Key information

Title
Peptidblanding, samt farmasøytisk sammensetning og kreftvaksine som innbefatter peptidblandingen
Application number
19992102
Case type
National
Status
30.04.2017 Ikke betalt årsavgift
Filed
30.04.1999
Effective date
30.04.1999
Publicly available
31.10.2000
Applicant
Norsk Hydro ASA (NO)
Owner
Targovax AS (NO)
Inventor
Marianne Klemp Gjertsen (NO) et al.
Agent
ZACCO NORWAY AS (NO)
Granted
02.04.2001
Patent number
309798

Abstract and drawing

Disclaimer: This text has been machine-scanned and may contain errors – please refer to "Publications" for legally binding content.
Denne oppfinnelsen dreier seg om syntetiske peptidblandinger som fremstimulerer T-ceUeimmunitet, for bruk i kreftvaksiner og sammensetninger for behandling moi kreft.

Publications

B1A
Checking availability of the latest published version...

Documents

 Expand Download files (6)
Date
 Date Doc. No. Process Case number In/Out Journal description To/from
 16.11.2017 03-01 Saksbehandling 19992102 UT PT Batch Opphørt Patent - SPC for ikke betalt årsavgift (3311)
07.09.2017 02-01 Saksbehandling 19992102 UT PT Batch Påminnelse om ikke betalt årsavgift (3329)
05.06.2012 02-01 Overdragelse av søknad/rettighet 2012/00427 UT GH Forespørsel Zacco Norway AS
 22.05.2012 01-03 Overdragelse av søknad/rettighet 2012/00427 INN Overdragelse eller navn adresseendring Zacco Norway AS
 22.05.2012 01-02 Overdragelse av søknad/rettighet 2012/00427 INN Fullmakt Zacco Norway AS
 22.05.2012 01-01 Overdragelse av søknad/rettighet 2012/00427 INN Generell henvendelse Zacco Norway AS
30.03.2005 01-02 Saksbehandling 309798 (19992102) INN Fullmakt
30.03.2005 01-01 Saksbehandling 309798 (19992102) INN Korrespondanse (hoved dok)

Description, claims and drawings

Disclaimer: This text has been machine-scanned and may contain errors – please refer to "Publications" for legally binding content. Description
Denne oppfinnelsen vedrører peptidblandinger, samt farmasøytiske sammensetninger og kreftvaksine som innbefatter en slik peptidblanding.Den genetiske bakgrunnen for at det oppstår kreft er endringer i proto-onkogener og onkogener og tumorsupressorgener. Proto-onkogener er normale gener i cellen som har potensiale for å bli til onkogener. Alle onkogener koder for og virker gjennom et protein. I et flertall av tilfellene er det påvist at de er komponenter av signaloverføringsbaner. Onkogener oppstår i naturen utfra proto-onkogener ved punktmutasjoner eller translokasjoner som fører til en omdannet tilstand av cellen som mutasjonen er oppstått i. Kreften utvikler seg gjennom en flertrinnsprosess som involverer flere mutasjonsbegivenheter i onkogener og tumorsupressorgener.I sin enkleste form kan utbytting av en enkelt base i et proto-onkogen føre til at produktet av genet blir forskjellig i en enkel aminosyre.I eksperimentelle modeller med svulster på mus er det påvist at punktmutasjoner i identitetsproteiner inne i cellen kan føre til at det oppstår antigener for tumoravvisning som består av peptider som er en eneste aminosyre forskjellig fra et normalt peptid. T-cellene som gjenkjenner disse peptidene i sammenheng med hovedhistokompatibilitetsmolekylene (MHC) på overflaten av tumorcellene, kan drepe tumorcellene og dermed avvise svulsten fra verten. (Boon, T. et al., Cell, 1989, Vol. 58, s. 293-303).I den humane kreftimmunologien er det de siste 20 årene gjort intense forsøk på å karakterisere ekte kreftspesifikke antigener.I begynnelsen ble det gjort mye arbeid med å analysere antistoffene til de menneskelige tumorantigenene. I henhold til teknikkens stand kan slike antistoffer brukes både for diagnostiske og terapeutiske formål, for eksempel som et middel mot kreft. Et problem er at antistoffer bare kan binde seg til tumorantigener som eksponeres på overflaten av tumorceller. Derfor har forsøkene på å lage en kreftbehandling som baserer seg på immunsystemet i kroppen vært mindre vellykket enn forventet.Antistoffer gjenkjenner til vanlig frie antigener i naturlig konformasjon og kan potensielt gjenkjenne nesten alle posisjoner som eksponeres på overflaten av antigenet. I motsetning til antistoffene som dannes av B-cellene, gjenkjenner T-cellene antigener bare når de er forbundet med MHC-molekyler, som betegnes HLA (humant leukocyttantigen) i mennesket, og bare etter en egnet behandling av antigenet. Denne er vanligvis en proteolytisk fragmentering av proteinet, som resulterer i peptider som passer inn i kløften i MHC-molekylene. Dette gjør det mulig for T-cellene å gjenkjenne også peptider som stammer fra proteiner inne i cellen. T-cellene kan dermed gjenkjenne avvikende peptider som stammer fra hvor som helst i tumorcellen, når de er forbundet med MHC-molekyler på overflaten av tumorcellen, og kan deretter aktiveres for å eliminere den tumorcellen som inneholder dette avvikende peptidet.HLA-molekylene kodes av HLA-regionen på det 6. menneskelige kromosomet. Klasse I-molekylene kodes av sublokasjonene HLA A, B og C og klasse II molekylene kodes av DR, DP og DQ sublokasj onene. Alle genproduktene er sterkt forskjelligartede. Forskjellige individer uttrykker altså distinkte HLA-molekyler som skiller seg fra HLA-molekylene til andre individer. Dette er bakgrunnen for vanskelighetene med å finne HLA-matchende organdonorer ved transplantasjoner. Den genetiske variasjonen i HLA-molekylene er spesielt viktig i immunobiologien på grunn av den rollen de spiller som immunresponsgener. Nærværet eller fraværet av visse HLA-molekyler bestemmer hvilken evne et individ har til å reagere på peptid-epitoper, på grunn av HLA-molekylenes evne til å binde peptider. HLA-molekylene avgjør altså om individet har motstandskraft eller er utsatt for sykdom.T-cellene kan kontrollere utvikling og vekst av kreft gjennom en rekke mekanismer. Cytotoksiske T-celler, både HLA klasse I restrikte CD8+ og HLA klasse II restrikte CD4+, kan direkte drepe de tumorcellene som har de riktige tumorantigenene. CD4+-hjelper-T-celler er nødvendige både for å fremstimulere og vedlikeholde reaksjonen fra cytotoksiske T-celler og fra antistoffreaksjonen, samt for å stimulere frem makrofag- og LAK-celle-dreping.Selv om det i henhold til teknikkens stand (d.v.s. den teknikkens stand som søkeren av den foreliggende patentsøknaden henviser til i W092/14756) er identifisert mange onkogener og deres proteinprodukter , og en nylig publisert undersøkelse har vist at T-cellerepertoaret til en frisk person inkluderer T-celler som er spesifikke for et syntetisk peptidfragment fra et p21 ras onkogenprodukt, er det ingen undersøkelser før W092/14756 som har definert de korrekte antigenene eller antigenposisjonene som gir tumorspesifikk T-celleimmunitet.W092/14756 er basert på tanken om at en mulig alternativ tilnærmingsmåte for bekjempelse av kreft er å bruke kroppens eget immunsystem ved å aktivere og styrke immunreaksjonen fra spesifikke T-celler. I W092/14756 fremlegges syntetiske peptider og fragmenter av onkogenproteinprodukter som fremstimulerer T-celleimmunitet, og kreftvaksiner og sammensetninger for behandling mot kreft som innbefatter de nevnte peptidene eller peptidfragmentene. Til tross for denne tidligere oppfinnelsen er det fortsatt behov for mer effektive produkter for kreftbekjempelse.Det har vært store betenkeligheter mot å bruke peptidblandinger til å vaksinere pasienter på grunn av den overhengende faren for at noen av peptidene i blandingen blir immunodominante og dermed undertrykker de andre peptidenes HLA-presentasjon. (Pion S, Christianson GJ, Fontaine P, Roopenian DC, Perreault C, Blood 1999 feb 1;93(3):952-62, Shaping the repertoire of cytotoxic T-lymphocyte responses: explanation for the immunodominance effect whereby cytotoxic T lymphocytes specific for immunodominant antigens prevent recognition of nondominant antigens.)Utfra eksperimenter som er utført in vitro er det kjent at forskjellige muterte ras-peptider kan konkurrere om bindingen til HLA-molekylet som er ansvarlig for presentasjon til de relevante T-cellene (W092/14756, figur 4, 5 og 7) og at peptider av samme lengde, men som representerer forskjellige mutasjoner kan hemme bindingen og gjenkjennelsen av et peptid som representerer en annen mutasjon med forskjellig grad av effektivitet (T. Gedde-Dahl III et al., Human Immunol. 33, 266-274,1992 og B.H. Johanssen et al., Scand. J. Immunol. 33, 607-612, 1994). På grunn av dette har immunodominansen vært ansett som et problem når det gjelder vaksiner laget av mutert ras-peptid.Imidlertid ble alle disse observasjonene gjort under slike eksperimentelle betingelser som kan oppnås utenfor kroppen. I en vaksinert pasient kan flere andre forhold bidra til funksjonell immunodominans for et visst peptid i en blanding av andre peptider. Spesielt interessant kan motstanden mot nedbrytning av proteolytiske enzymer i vevet være hvor antigenet injiseres, noe som kan influere halveringstiden for peptidene i kroppen, og videre forskjeller i hydrofobi som kan ha en innflytelse på hastigheten som peptidene opptas med av de relevante antigenpresenterende cellene i vevet. I motsetning til hva man ville forvente utfra eksperimentene utenfor kroppen fant oppfinnerne til sin overraskelse at immunresponsen var betydelig høyere hos de gruppene av pasienter med kolorektal kreft og kreft i bukspyttkjertelen som var behandlet med en cocktail av muterte ras-peptider enn ved behandling med enkeltvis ras-peptider som beskrevet i W092/14756. Disse resultatene viser at i stedet for å konkurrere med de andre peptidene og dermed gi opphav til immunodominans, kan et peptid gi opphav til en immunreaksjon som kommer i tillegg til reaksjonen mot de andre peptidene i blandingen. Dette fenomenet kan best forklares ved en positiv tilbakekoblingsløkke som oppstår ved kaskaden av T-hjelperrelaterte kjemokiner og cytokiner som vil bli frigjort i starten etter at T-cellen er aktivert av en peptidspesifikk T-celle. Disse faktorene vil rekruttere flere profesjonelle antigenpresenterende celler og T-celler til lymfeknuten hvor aktiveringen finner sted og deretter også til vaksinestedet, og vil også gi opphav til en forsterkning av produksjonen av de vekst- og modningsfaktorene som kreves for vellykket T-celleformering. Det logiske grunnlaget for den forsterkende tilbakekoblingseffekten er at antallet T-celler som har potensiale for å gjenkjenne alle peptidene i blandingen er mye større enn antallet T-celler som er spesifikke for et enkelt peptid. I samspill vil aktiveringen av flere T-celler som er spesifikke for individuelle peptider som finnes i peptidblandingen øke graden av reaksjon også mot enkelte peptider i blandingen.i Videre ble det overraskende funnet at ras-peptider i de innsprøytede cocktailene som ikke svarer til den ras-mutasjonen som faktisk fantes i svulsten til pasienten, også dannet T-celler som var klinisk relevante på grunn av en kryss reaktivitet med peptider som svarer til den faktiske mutasjonen. Virkningen av å bruke en blanding av ras-peptider er derfordobbelt, den forsterker de T-cellene som er spesifikke for et enkelt peptid og gir i tillegg en andre komponent som består av T-cellekloner som er spesifikke for et annet peptid, men som samtidig reagerer med den tumorrelevante mutasjonen. Slike T-cellekloner kan ellers ikke fås ved vaksinasjon med enkeltpeptider, da de ikke ble observert hos pasienter som ble behandlet med en enkeltpeptidvaksinasjon.Det er altså et hovedformål ved oppfinnelsen å fremskaffe mer effektive behandlingsmidler, vaksiner og farmasøytiske sammensetninger enn de som fremlegges i W092/14756 for forebyggelse og/eller behandling av kreft.Et annet formål ved oppfinnelsen er å fremskaffe et behandlingsmiddel, en vaksine og en farmasøytisk sammensetning som stimulerer frem immunreaksjoner og aktivering av T-celler.Peptidene som brukes i peptidblandingene i denne oppfinnelsen utgjøres av peptidene og peptidfragmentene som fremlegges i W092/14756. Det henvises derfor til beskrivelsen av W092/14756.Oppfinnelsen forklares i mer detalj ved de følgende eksemplene og de vedlagte figurene.Betegnelsen "sekvens-id. nr." er i figurene forkortet med "s. id."I figur 1 sammenliknes resultatene fra to kliniske tester med vaksinasjon med posisjon 12-og/eller posisjon 13-muterte ras-peptider av pasienter med kolorektal kreft.I figur 1 sammenliknes resultatene fra to kliniske tester med vaksinasjon av pasienter med kreft i bukspyttkjertelen med posisjon 12- og/eller posisjon 13-muterte ras-peptider.Figur 3 viser forskjellige reaksjonsmønstre for fire pasienter med kolorektal adenokarsinom som ble vaksinerte med en cocktail av fem forskjellige posisjon 12- og posisjon 13-muterte ras-peptider, sekvens-id. nr. 2, 3,4, 6 og 7.Figur 4 viser forskjellige T-cellereaksjoner mot individuelle muterte ras-peptider for to reagerende pasienter.Figur 5 viser reaktiviteten av perifere T-celler fra en pasient med kolorektal adenokarsinom etter vaksinasjonen.Figur 6 viser reaktiviteten av tumorinfiltrerende lymfocytter (TIL) fra en pasient med fremskreden kreft i bukspyttkjertelen etter vaksinasjonen.Den sterke kryss reaktiviteten til ras-spesifikke T-celler som var dannet ved vaksinasjon med en blanding av ras-peptider med forskjellige ras-mutasjoner ble også demonstrert på klonenivå. Dette vises på figur 7.Figur 8 viser hvor spesifikke T-cellekloner fra pasienter med malignt melanom blir etter vaksinasjon med en cocktail av fire forskjellige posisjon 61-muterte ras-peptider, sekvens-id. nr. 9, 10,11 og 10.Peptidene ble fremstilt ved peptidsyntese i fast fase. Det ble brukt N-a-Fmoc-aminosyrer med egnet sidegrenbeskyttelse ( Ser(tBu), Thr(tBu), Lys(Boc), His(Trt), Arg(Pmc), Cys(Trt), Asp(O-tBu), Glu(O-tNu)). Fmoc-aminosyrene ble aktivert med TBTU før bindingen. 20 % piperidin i DMF ble brukt for å fjerne Fmoc selektivt etter hvert bindingstrinn. Løsgjøring fra resinet og endelig fjerning av sidegrenbeskyttelsen ble gjort med en 95 % TFA(aq) som inneholdt egnede skavenger. Peptidene ble renset og analysert med omvendt fase. Peptidene ble analysert og karakterisert med standardmetoder for peptider.Tabell 1. RAS-peptider med mutasjon i posisjon 12 og 13 og den tilsvarende normale p21-sekvensen.8Tabell 2. RAS-peptider med mutasjon i posisjon 61 og den tilsvarende normale p21-sekvensen.Vaksinasjon med en cocktail av ras-peptider i stedet for enkeltvis peptider øker effektiviteten av vaksinasjonen. Ved å sammenlikne de to typene vaksinasjonsregimer i grupper av kreftpasienter med kreft i bukspyttkjertelen eller kolorektal kreft, fant vi at andelen av pasientene som fikk en immunreaksjon er vesentlig høyere i grupper av kreftpasienter som vaksineres med en cocktail av muterte ras-peptider enn ved vaksinasjon med enkelte ras-peptider. Dette vises for pasienter med kolorektal kreft og kreft i bukspyttkjertelen henholdsvis i figur 1 og 2.I figur 1 sammenliknes resultatene fra to kliniske tester med vaksinasjon av kolorektale kreftpasienter med ras-peptider mutert i posisjon 12 og/eller posisjon 13.1 den ene testen ble pasientene vaksinert med et eneste mutert ras-peptid, enten sekvens-id. nr. 2, 3,4, 6 eller 7, og i den andre testen ble en cocktail av alle de fem muterte ras-peptidene brukt til vaksinasjonen. Av pasientene som ble vaksinert med et eneste peptid fikk 52% (14 av 27 vaksinerte pasienter) en immunreaksjon, og av pasientene som fikk cocktailen av de fem peptidene var andelen som fikk en immunreaksjon 67% (18 av de 23 vaksinerte pasientene). Det ene peptidet ble innsprøytet under huden til Dukes B- og C-pasienter sammen med GM-CSF (30 mg) i to serier, først 4 injeksjoner av 100 mg peptid med en ukes mellomrom mellom hver dose, og så, fire uker etter den siste injeksjonen ble det gitt 4 x 300 mg, igjen med en uke mellom hver dose på 300 mg. Cocktailen med de fem peptidene ble gitt til Dukes C- og D-pasienter sammen med GM-CSF (30 mg) som fire injeksjoner av 500 mg cocktail (100 mg av hver peptid) med en uke mellom hver injeksjon for 15 av pasientene, og som fire injeksjoner med 2000 mg cocktail (400 mg av hvert peptid) for 12 av pasientene. Antall pasienter som fikk reaksjoner var 10 i gruppen som fikk den lave dosen (67%) og 8 i gruppen som fikk høy dose (67%). Det må bemerkes at pasientgruppen som fikk vaksinasjon med et eneste peptid overveiende besto av pasienter som var i bedre klinisk tilstand (hovedsakelig opererte kreftpasienter i Dukes trinn B og C), mens pasientgruppen som fikk vaksinecocktailen hovedsakelig inneholdt pasienter med fremskreden sykdom (Dukes trinn D, med levermetastaser, som ikke reagerte på kjemoterapi/strålebehandling). Det er tenkelig at tilstanden av immunsystemet i den sistnevnte gruppen var dårligere enn i den første, siden både forutgående behandling (cytostatika og stråling) og stor svulstbyrde kan hemme immunfunksjonene betydelig. Derfor var det svært uventet for oss at antallet som fikk reaksjoner på vaksinen var høyere i gruppen med fremskreden sykdom.Økte doser førte ikke til noe høyere antall pasienter som reagerte, liksom økte doser av enkeltpeptidvaksinene for de samme pasientene heller ikke økte antallet pasienter som reagerte, og i to grupper med høy og lav dose av peptidcocktail var også andelen som reagerte den samme.I figur 2 sammenliknes resultatene fra to kliniske tester av vaksinasjon av pasienter med kreft i bukspyttkjertelen med ras-peptider med mutasjon i posisjon 12.1 den ene testen ble pasienter som var operert for kreft i bukspyttkjertelen (Whippel-operasjon) vaksinert med et eneste mutert ras-peptid, enten sekvens-id. nr. 2, 3, 4 eller 6, og i den andre testen på pasienter med ikke-opererbar (terminal) kreft i bukspyttkjertelen ble en cocktail som inneholdt alle de fire muterte ras-peptidene brukt til vaksinasjonen. Igjen observerte vi at de pasientene med fremskreden sykdom som fikk vaksinecocktailen var i stand til å reagere på vaksinen til tross for sin svekkede kliniske tilstand, og overraskende fant vi at antallpasienter som reagerte var høyere i denne gruppen av pasienter med uopererte svulster enn hos de opererte i den andre gruppen som fikk enkeltpeptidvaksiner. Hos pasientene som blevaksinert med et eneste peptid fikk 42% (5 av 12 vaksinerte pasienter) en immunreaksjon, og hos pasientene som fikk cocktailen med de fire peptidene var andelen med immunreaksjon 56% (19 av de 34 vaksinerte pasientene). Enkeltpeptidet ble sprøytet inn under huden på de tumoropererte pasientene sammen med GM-CSF (30 (ig) i seks injeksjoner på 100 (lg peptid med en uke mellom de første fire dosene, to uker mellom dose fire og fem og fire uker mellom dose fem og seks. Cocktailen på fire peptider ble gitt til ikke-opererbare pasienter sammen med GM-CSF (30 jig) i seks injeksjoner på 400 ug (100 [ Lg av hvert peptid) etter samme skjema som for enkeltpeptidene.Igjen observerte vi at de pasientene med fremskreden sykdom som fikk cocktailen var i stand til å reagere på vaksinen til tross for sin svekkede kliniske tilstand, og overraskende fant vi at andelen som reagerte også var høyere i pasientgruppen med uopererte svulster som fikk vaksinecocktail.De kombinerte resultatene som er gjengitt i figur 1 og 2 viser at vaksinecocktailen er bedre enn enkeltpeptidvaksiner og er svært effektiv også under kliniske forhold som ikke er gunstige for en immunreaksjon.Dessuten viser figur 3 og 4 at ved å vaksinere med blandinger av ras-peptider er det mulig å stimulere T-celler til å reagere mot alle de forskjellige peptidene i blandingen.Figur 3 viser forskjellige reaksjonsmønstre hos fire pasienter med kolorektalt adenokarsinom som var vaksinert med en cocktail av fem forskjellige ras-peptider mutert i posisjon 12 og 13, sekvens-id. nr. 2, 3, 4, 6 og 7. Peptidcocktailen ble sprøytet inn under huden på pasienter med kolorektalt adenokarsinom sammen med GM-CSF (30 (xg) i fire ukentlige injeksjoner på 0,5 mg peptidcocktail. T-cellereaksjonene ble testet i prøver fra før og etter vaksinasjonene etter en stimulering utenfor kroppen. Alle fire pasientene viste også utvikling av en positiv DTH-reaksjon på vaksinecocktailen. Resultatene i figur 3 bleoppnådd ved hjelp av standard proliferasjonsassays og peptider med sekvens-id. nr. 2, 3,4, 6, 7 og 8 (normaltypen). Resultatene viser at en pasient fikk en immunreaksjon mot alle de fem peptidene i cocktailen, mens de tre andre pasientene fikk en immunreaksjon mot fire av de fem peptidene som ble brukt i vaksinen.Siden reaktiviteten med normaltypepeptidet ikke ble observert i blodprøvene som ble tatt før vaksinasjonen, men bare i prøver fra etter vaksinasjonen (pasient 2 og 3), og siden peptidet med sekvens-id. nr. 8 ikke var med i vaksineblandingen må denne reaktiviteten stamme fra stimulering av kloner av T-celler med evne til å reagere både med den normale ras-sekvensen og sekvenser som inneholder noen av de aminosyresubstitusjonene som ble innført ved mutasjonen. Ikke i noe tilfelle ble sidereaksjoner som tydet på en autoimmun reaksjon observert hos pasienter som viste en slik kryss reaktivitet. Dette kan ha forbindelse med det faktum at nivået av uttrykkingen av p21 ras i svulster er høyere enn i tilsvarende ikke-omdannet vev.I figur 4 vises de forskjellige T-cellereaksjonene mot individuelle muterte ras-peptider med sekvens-id. nr. 2, 3,4 og 6 for to uopererte pasienter med kreft i bukspyttkjertelen. T-cellereaksjonene ble undersøkt utenfor kroppen i perifere mononukleære blodceller (PBMC). Her ble PBMC fra de to pasientene testet mot de 4 enkelte mutantpeptidene (sekvens-id. nr. 2, 3, 4 og 6) og det normale ras-peptidet (sekvens-id. nr. 8) etter en stimulering utenfor kroppen. PBMC ble i kort tid utsådd med lx IO6 pr. brønn i 24-brønnersplater (Costar) med 25 \ iM av det enkelte muterte ras-peptidet eller blandingen av muterte ras-peptider i 1 ml RPMI-1640 (Gibco, Paisley, UK) substituert med 15% varmeinaktivert humant serum. Etter tre dagers kultur ble mediene supplementert med 10 U/ml IL-2 (Amersham). Kulturcellene (5xl04 / brønn) ble testet etter 9 - 12 dager for spesifikk proliferasjonskapasitet mot enkelte muterte ras-peptider/peptidblanding og normalt ras-peptid ved en konsentrasjon på 25 |iM, med eller uten IL-2 (1 U/ml), ved å bruke autologisk, bestrålt (30 Gy) PMBC (5xl04 celler brønn) som APC. Formeringen ble målt dag 3 etter inkubasjon over natten med 3H-tymidin 3,7xl04 Bq/brønn (Amersham). Verdiene er gitt som gjennomsnittlige tellinger pr. minutt (cpm) fra triplikater. En antigenspesifikk reaksjon ble ansett for positiv hvis stimuleringsindeksen (SI) (reaksjon med antigen dividert med reaksjon uten antigen) var over 2. Begge pasientene fikk en immunreaksjon mot alle underkomponentene av vaksinen (sekvens-id. nr. 2, 3, 4 og 6).Figur 5 viser reaktiviteten av perifere T-celler fra en pasient med kolorektal adenokarsinom etter vaksinasjon. Pasienten fikk en vaksinasjon med en cocktail av syv forskjellige ras-peptider med mutasjoner i posisjon 12 og 13, sekvens-id. nr. 1, 2, 3, 4, 5, 6 og 7. Peptidcocktailen ble sprøytet inn under huden til en pasient med fremskreden kolorektal kreft (Dukes D) sammen med GM-CSF (30 ug) i fire ukentlige injeksjoner av 0,7 mg peptidcocktail på fire forskjellige steder. Resultatene viser at det er dannet T-celler som reagerer med fem av de forskjellige ras-mutasjonene, men det er ikke noen felles reaktivitet overfor normalt ras. T-cellereaksjonene ble undersøkt som beskrevet ovenfor. PBMC ble testet i kort tid etter en stimulering in vitro i standard proliferasjonsassays med peptider som hadde sekvens-id. nr. 1, 2, 3,4, 5, 6, 7 og 8 (normaltypen).Videre er det påvist at vaksinasjon med cocktails av ras-peptider gir T-celler som er kryss reaktive for de forskjellige ras-mutasjonene. Dette er påvist i figurene 6,7 og 8.Figur 6 viser reaktiviteten av tumorinfiltrerende lymfocytter (TIL) etter vaksinasjon av en pasient med fremskreden kreft i bukspyttkjertelen. Pasienten fikk en vaksinasjon med en cocktail som besto av fire forskjellige ras-peptider mutert i posisjon 12, sekvens-id. nr. 2, 3, 4 og 6. Peptidcocktailen ble sprøytet inn under huden til en pasient med fremskreden kreft i bukspyttkjertelen sammen med GM-CSF (30 |j,g) i seks injeksjoner på 0,4 mg peptidcocktail med en uke mellom de første fire dosene, to uker mellom dose fire og fem og fire uker mellom dose fem og seks. T-cellene stammet fra en tumorbiopsi tatt etter at pasienten var vellykket immunisert med peptidvaksinasjonen (positiv DTH-test). TIL-cellene ble ekspandert en hel del utenfor kroppen ved samkultur i rekombinant humant interleukin 2 (rIL2) og det ble påvist at de homogent uttrykte den samme T-cellereseptorkjeden Vp ved analyse med monoklonale antistoffer, noe som tydet på en den TIL-cellelinjen som var dannet var av monoklont opphav. Resultatene i figur 6 viser at TIL-cellelinjen reagerer med alle de fire forskjellige muterte ras-peptidene som fantes i vaksinecocktailen. TIL ble testet i standard proliferasjons assays med peptider av sekvens-id. nr. 2, 3, 4 og 6.Den brede kryss reaktiviteten med forskjellige ras-mutasjoner for ras-spesifikke T-celler som var dannet ved vaksinasjon med en blanding av ras-peptider, ble også påvist på et klonalt nivå. Figur 7 summerer opp spesifisiteten til fem T-cellekloner etter vaksinasjon av en pasient med fremskreden kreft i bukspyttkjertelen med en cocktail av fire forskjellige ras-peptider som var mutert i 12-posisjonen, sekvens-id. nr. 2, 3,4 og 6. Resultatene viser at T-celleklonene enten kan være strengt spesifikke for en enkelt ras-mutasjon som beskrevet før (TLC1, TLC2 og TLC4) eller reaktive for to eller flere forskjellige ras- mutasjoner (TLC4 og TLC5). Det var ikke noen TLC fra denne pasienten som viste tegn til kryss reaktivitet med normaltype-ras (sekv.-id. nr. 8). Peptidcocktailen ble gitt som beskrevet for figur 6. T-celleklonen kom fra blodprøver av pasienter som fikk en immunreaksjon til vaksinen ifølge en positiv forsinket overfølsomhetstest (DTH), ved kloning under begrensende fortynningsbetingelser. Resultatene i figur 7 ble oppnådd med standard proliferasjons assays og peptider med sekvens-id. nr. 2, 3, 4, 6 og 8 (normal).Figur 8 viser hvor spesifikke T-cellekloner fra det perifere blodet blir etter vaksinasjon av melanom-pasienter med en cocktail av fire forskjellige ras-peptider med mutasjon i posisjon 61, sekvens-id. nr. 9, 10, 11 og 10. Resultatene viser at det dannes både T-celler som er strengt spesifikke for enkelte ras-mutasjoner og T-celler som er reaktive for to, tre eller fire forskjellige ras-mutasjoner ved vaksinasjon med denne peptidcocktailen. Ingen av de undersøkte T-celleklonene viste noen tegn til kryss reaktivitet med normalt ras. Peptidcocktailen ble innsprøytet under huden på tumoropererte pasienter sammen med GM-CSF (30 LLg) i seks injeksjoner på 0,32 mg peptidcocktail med en uke mellom de første fire dosene, to uker mellom dose fire og fem og fire uker mellom dose fem og seks. T-celleklonene kom fra blodprøver av pasienter som viste en immunreaksjon på vaksinen ifølge en positiv forsinket overfølsomhetstest (DTH), etter kultur av T-celler under begrensende fortynningsbetingelser. Resultatene i figur 8 ble oppnådd med standard proliferasjonsassays og peptider med sekvens-id. nr. 13, 14, 15, 16 og 17 (normaltype).Det som følger av dette er at også de ras-peptidene i de innsprøytede cocktailene som ikke svarte til den ras-mutasjonen som faktisk eksisterte i svulsten til pasientene, også danner T-celler som er klinisk relevante på grunn av kryss reaktiviteten. Kryss reaktive T-celler observeres aldri etter enkeltpeptidvaksinasjoner og ras-peptidcocktailer er en ny måte å ytterlig styrke en immunreaksjon mot ras-mutasjoner som er forbundet med kreft. Dataene våre viser at et flertall av pasientene som fikk en cocktail av muterte ras-peptider viser immunreaksjoner mot de fleste av subkomponentene i vaksinepreparatet. Dette er av meget stor betydning, og viser at det ikke er noen immunodominans mellom de forskjellige muterte ras-peptidene og at peptidene presenteres for T-celler av de fleste vanlige HLA-molekylene. Dermed kan kreftvaksiner som består av forskjellige muterte ras-peptider brukes kliniske med stor bredde uten at det er nødvendig å bestemme HLA-typen og ras-mutasjonen på forhånd. Hvis man bruker en cocktail av muterte peptider vil faktisk alle de klinisk relevante allment reaktive T-cellene dannes i pasienten. Resultatene i figur 6 som viser reaktivitet mot mutert ras hos tumorinfiltrerende lymfocytter som observeres i biopsiprøver etter peptid vaksinasjon er av stor betydning fordi de viser at allment reaktive T-celler er i stand til å lokalisere svulstområdet på stedet.Peptidblandingen i henhold til denne oppfinnelsen kan gis til pasienten på den måten som beskrives i W092/14756.Peptidblandingene i henhold til denne oppfinnelsen kan gis i en mengde som ligger i området fra 1 nanogram (1 ng) til 1 gram (1 g) til humane gjennomsnitts-pasienter eller individer som skal vaksineres. Det foretrekkes å bruke en dose i området 1 mikrogram (1 [ lg) til 1 milligram (1 mg) til hver innsprøytning.
Claims
1. Peptidblanding karakterisert ved at den omfatter minst to forskjellige peptider, hvor hvert peptid a) har en aminosyresekvens som det naturlig p21 ras proteinet eller er et fragment derav bortsett fra at aminosyren Gly i posisjon 12 og/eller 13, og/eller aminosyren Gin i posisjon 61 er erstattet av en hvilken som helst annen aminosyre; b) tilsvarer, dekker fullstendig eller er et fragment av et bearbeidet fragment av et onkogenprotein som presenteres av en kreftcelle eller andre antigenpresenterende celler (APC);og c) induserer spesifikke T-celleresponser mot det faktiske onkogenproteinfragmentet som dannes av cellen ved bearbeiding og som presenteres i HLA-molekylet.2. Peptidblanding ifølge krav 1, karakterisert ved at peptidene er valgt uavhengig fra en gruppe bestående av A og B: A) peptider som har sekvensidentitetsnr. 1, 2, 3, 4, 5, 6 og 7 eller fragmenter av disse, B) peptider som har sekvensidentitetsnr. 9, 10, 11, 12, 13, 14,15 og 16 eller fragmenter av disse.3. Peptidblanding ifølge et hvilket som helst av krav 1 eller 2,karakterisert ved at den omfatter 4 forskjellige peptider.4. Peptidblanding ifølge et hvilket som helst av krav 1 eller 2,karakterisert ved at den omfatter 5 forskjellige peptider.5. Peptidblanding ifølge et hvilket som helst av krav 1 eller 2,karakterisert ved at den omfatter 7 forskjellige peptider.6. En farmasøytisk sammensetning som innbefatter en peptidblanding som definert i krav 1-5, alene eller sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer, fortynningsmiddel, eksipient og/eller GM-CSF.7. En kreftvaksine som innbefatter en peptidblanding som definert i krav 1-5, alene eller sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer, fortynningsmiddel, eksipient og/eller GM-CSF.
Drawings

Priority

No priority

Patent classes

IPC classesA61K 38/00A61K 39/00A61P 35/00C07K 14/82A61K038/10

Citations

No publications found

Applicants, owners and inventors

Owners
Targovax AS
Vollsveien 6 1366 LYSAKER NO (BÆRUM Municipality, Akershus county)Org. number: 996162095Inventors
Marianne Klemp Gjertsen
Terneveien 10 1335 SNARØYA NO (BÆRUM Municipality, Akershus county)
Gustav Gaudernack
Anthon Walles vei 17 A 1337 SANDVIKA NO (BÆRUM Municipality, Akershus county)
Jon Amund Eriksen
Bjørntvedtgaten 37 3916 PORSGRUNN NO (PORSGRUNN Municipality, Telemark county)
Mona Møller
Skrukkerødtoppen 8 3925 PORSGRUNN NO (PORSGRUNN Municipality, Telemark county)

Agent

ZACCO NORWAY AS
ZACCO NORWAY AS

Org. number: 982702887

Name and address are automatically synchronized with the Brønnøysund Register Centre.

Open in The Brønnøysund Register Centre
Postboks 488 0213 OSLO NO (OSLO Municipality, Oslo county)
Org. number: 982702887
Reference: P9934

Status history

Payment history

Oppositions and appeals

No oppositions or appeals

Administrative limitation

No administrative limitation

Liens and licences

No liens or licenses registered

Gazette entries

No Gazette entries foundOnly events from 2024.03.04 and onwards are shown.