Key information

Title
Fremgangsmåte for å forbedre oppdrett av pre-voksen anadrom fisk og anvendelse av fôr for konsum av anadrom fisk
Application number
20031703
Case type
PCT-based
Status
2021.10.11 Patent protection period expired
Filed
2003.04.11
Priority
2000.10.12 US 687372 and others
International application date
2001.10.11
International application number
PCT/US2001/31562
Effective date
2001.10.11
Publicly available
2003.06.12
Applicant
MariCal Inc (US)
Owner
MariCal Inc (US)
Inventor
William H Harris Jr (US) et al.
Agent
BRYN AARFLOT AS (NO)
Granted
2008.06.09
Patent number
325534
Expiry date
2021.10.11

Abstract and drawing

Disclaimer: This text has been machine-scanned and may contain errors – please refer to "Publications" for legally binding content.
Oppfinnelsen angår fremgangsmåter, preparater og testsett for å forbedre oppdrettet av prevoksen anadrom fisk eller preparing av pre-voksen anadrom fisk for overføring til sjøvann. Fremgangsmåtene involverer tilsetning av minst én polyvalent kation-følende reseptor (PVCR)- modulator til ferskvannet i en mengde tilstrekkelig til å øke ekspresjon og/eller sensitivitet av minst én PVCR; og tilsetning av får for fiskekonsum til ferskvannet, hvor fåret omfatter en mengde av NaCl tilstrekkelig til å bidra til et betydelig øket nivå av PVCRmodulator i serum av den pre-voksne anadrome fisk.

Publications

Latest published versionB1A

Documents

 Expand Download files (9)
Date
 Date Doc. No. Process Case number In/Out Journal description To/from
 2021.11.01 16-01 Examination 20031703(325534) OUT PT Utløpt 20 år (3315)
2019.09.27 15-01 Examination 20031703 OUT Bekreftelse på mottatt melding om søksmål
2019.09.27 14-01 Examination 20031703 IN Melding om søksmål
2019.03.08 13-01 Examination 20031703 OUT PT Påminnelse om ikke betalt årsavgift (3329) (PT20031703)
2018.03.06 12-01 Examination 20031703 OUT PT Batch Påminnelse om ikke betalt årsavgift (3329)
2017.03.06 11-01 Examination 20031703 OUT PT Batch Påminnelse om ikke betalt årsavgift (3329)
2016.01.07 10-01 Examination 20031703 OUT PT Batch Påminnelse om ikke betalt årsavgift (3329)
2015.01.26 09-01 Examination 20031703 OUT PT Batch Påminnelse om ikke betalt årsavgift (3329)
2014.01.09 08-01 Examination 20031703 OUT Batch STARTGRACE Patent varsel ikke betalt
2008.06.11 07-01 Examination 20031703 OUT PT RegistreringsBrev (2008.06.11)
2008.06.02 06-01 Examination 20031703 OUT Patentskrift
2008.05.26 05-03 Examination 20031703 IN Patenttegninger
2008.05.26 05-01 Examination 20031703 IN Korrespondanse (hoved dok)
2008.03.14 04-01 Examination 20031703 OUT PT Medelelse om patent
2008.03.07 03-05 Examination 20031703 IN Beskrivelse
2008.03.07 03-04 Examination 20031703 IN Krav
2008.03.07 03-03 Examination 20031703 IN Krav
2008.03.07 03-01 Examination 20031703 IN Korrespondanse (hoved dok)
2008.02.05 01-01 Examination 20031703 OUT PT Realitet_patent (2008.02.05)
2007.09.28 02-03 Examination 20031703 IN Annet dokument
2007.09.28 02-01 Examination 20031703 IN Korrespondanse (hoved dok)

Description, claims and drawings

Disclaimer: This text has been machine-scanned and may contain errors – please refer to "Publications" for legally binding content. Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for å forbedre oppdrett av pre-voksen anadrom fisk og anvendelse av for for konsum av anadrom fisk.I naturen lever mange anadrome fisk mesteparten av deres voksne liv i sjøvann, men svømmer oppstrøms til ferskvann for forplantning. Som et resultat utklekkes anadrome fisk fra deres egg og blir født i ferskvann. Ettersom disse fiskene vokser, svømmer de nedstrøms og tilpasser seg gradvis til sjøvannet.Fiskoppdrettsanlegg har opplevet vanskelighet med oppdrett av disse typer av fisk fordi tidsspekteret hvor pre-adult fisk tilpasser seg sjøvann (f.eks. blir smolt) er kortvarig og kan være vanskelig å bestemme nøyaktig. Som et resultat opplever disse oppdrettsanlegg betydelig sykdom og dødelighet når de overfører anadrome fisk fra ferskvann til sjøvann. I tillegg er mange av fiskene som overlever overføringen fra ferskvann til sjøvann stresset og erfarer følgelig redusert matinntak og øket mottagelighet for sykdom. Derfor vokser disse anadrome fisk ofte ikke godt etter at de er overført til sjøvann.Akvakulturindustrien taper millioner av dollar hvert år på grunn av problemer den møter ved overføring av pre-adult anadrome fisk fra ferskvann til sjøvann. Således eksisterer et behov for å forbedre metoder involvert i overføring av pre-voksne anadrome fisk til sjøvann. Et ytterligere behov eksisterer for å øke overlevelse og vekst og redusere stress hos pre-voksne anadrome fisk som er overført til sjøvann.Foreliggende oppfinnelse angår fremgangsmåte for å forbedre oppdrett av pre-voksen anadrome fisk, hvor den pre-voksne anadrome fisk blir holdt i ferskvann før overføring til sjøvann, omfattende: a) tilsetning av minst én polyvalent kation-følende reseptor (PVCR)-modulator til ferskvannet i en mengde tilstrekkelig til å modulereekspresjon og/eller sensitivitet av minst én PVCR i nevnte pre-b) tilsetning av fdr for fiskekonsum til ferskvannet, hvor foret inneholder et middel som bidrar til et betydelig øket nivå av nevnte PVCR-modulator i serumav den pre-voksne anadrome fisk av nevnte pre-voksen anadrome fisk konsumerer foret.PVCR refererer til Polyvalent Cation Sensing Receptor. Modulering av PVCR omfatter endringer i PVCR-protein og mRNA-ekspresjon så vel som endringer av PVCR-sensitivitet ved å underkaste pre-adult anadrome fisk for minst én modulator av PVCR. Den pre-voksne anadrome fisk blir underkastet modulatoren når den blir satt til deres ferskvannsomgivelse og eventuelt, til foret. Oppfinnelsen omfatter tilsetning av minst én PVCR-modulator til ferskvann og tilsetning av for for fiskekonsum til ferskvannet, hvor foret har et middel som er tilstrekkelig til bidra til et betydelig øket nivå av PVCR-modulator i serumet til fisken. I én utførelsesform er midlet natriumklorid (NaCI). Således inneholder foret NaCI og eventuelt minst én PVCR-modulator i en mengde som bidrar til et betydelig øket nivå av en PVC- modulator i serumet til den pre-voksne anadrome fisk. Modulert ekspresjon og/eller sensitivitet av PVCR blir holdt inntil fisken er klar til å bli overført til sjøvann. Den pre-voksne anadrome fisk kan holdes i ferskvann som har minst én PVCR-agonist inntil de er klare til å overføres til sjøvann. Foreliggende oppfinnelse omfatter også eventuelt eksponering av den pre-voksne anadrome fisk for en fotoperiode. Den bør være tilstrekkelig til å øke vekst og/eller smoltifisering både før og umiddelbart etter deres overføring til sjøvann. Fortrinnsvis er fotoperioden kontinuerlig. Fotoperioden kan være i et område mellom ca. 12 timer til ca. 24 timer i løpet av en 24 timers periode. Ved overføring av fisken til sjøvann kan de bli eksponert for en kontinuerlig fotoperiode. I ett eksempel blir disse pre-voksne anadrome fisk som veier så lite som ca. 15 gram eller så meget som ca. 120 gram overført til sjøvann.Foreliggende oppfinnelse vedrører videre anvendelse av et for for konsumpsjon av anadrome fisk i ferskvann for anvendelse i fremgangsmåten ifølge krav 1, hvor fåret omfatter: a) én eller flere kilder av ernæring; b) en mengde av NaCI mellom ca. 10.000 mg/kg og ca. 100.000 mg/kg; og c) minst én PVCR-modulator;De pre-voksne anadrome fisk (f.eks. laks, ørret og arktisk røye) blir forberedt for overføring fra ferskvann til sjøvann ved tilsetning av PVCR-agonister, så som kalsium og magnesium til ferskvannet og tilsetning av for for fiskekonsum som har mellom ca. 1% og ca. 10% NaCI etter vekt (f.eks. mellom ca. 10,000 mg/kg og 100,000 mg/kg) til ferskvannet. Mengden av kalsium satt til ferskvannet er en mengde tilstrekkelig til å bringe konsentrasjonen opp til mellom ca. 2,0 mM og ca. 10,0 mM og mengden av magnesium tilsatt er en mengde tilstrekkelig til å bringe konsentrasjonen opp til mellom ca. 0,5 mM og ca. 10,0 mM. Foret kan eventuelt omfatte en PVCR-agonist, så som en aminosyre. En spesiell aminosyre som kan tilsettes er tryptofan i en mengde mellom ca. 1 g/kg og ca. 10 g/kg. Den pre-voksne anadrome fisk kan utsettes for en fotoperiode i en tilstrekkelig tid til å øke vekst og/eller smoltifisering. Fortrinnsvis er fotoperioden kontinuerlig (f.eks. i en periode på mellom ca. 12 timer og ca. 24 timer i løpet av en 24 timers periode). En kontinuerlig fotoperiode kan skje i 1 dag til mange dager, som beskrevet her, før og etter sjøvannsoverføring.Det er mulig å øke eller forbedre matkonsum før og/eller etter sjøvanns-overføring, øke vekst, øke overlevelse og/eller redusere dødelighet, forbedre foromdannelsesforholdet (FCR), øke den spesifikke vekstgrad (SGR), redusere osmotisk skade, overføre parr (f.eks. mellom ca. 15 og ca. 60 gram) til sjøvann og overføre pre-voksne anadrome fisk til sjøvann som har en forhøyet temperatur på ca. 14°C til ca. 19°C. Dette kan oppnås ved å tilsette minst én PVCR-modulator til ferskvannet, underkaste eller eksponere den pre-voksne anadrome fisk for minst én PVCR-modulator eller innføre den pre-voksne anadrome fisk i ferskvann som har minst én PVCR-modulator, i en mengde tilstrekkelig til å modulere ekspresjon og/eller sensitivitet av PVCR. Metodene involverer oså tilsetning av for som har minst ca. 1% NaCI etter vekt til ferskvannet og overføring av den pre-voksne anadrome fisk til sjøvann.Foreliggende oppfinnelse vedrører videre en fremgangsmåte ifølge krav 6, hvor tilsetning av minst én PVCR-modulator tii ferskvannet omfatter tilsetning av kalsium til ferskvannet i en mengde som er tilstrekkelig for å bringe kalsiumkonsentrasjonen opp til mellom omtrent 2,0 mM og omtrent 10,0 mM, og tilsetning av magnesium til ferskvannet i en mengde tilstrekkelig for å bringe magnesium konsentrasjonen opp til mellom ca. 0,5 mM og ca. 10,0 mM. Metoder for å øke Natrium Kalium ATPase- (Na+ K+ ATPase) aktivitet i klorid-celler i vev (f.eks. gjelle) av pre-voksne anadrome fisk eller redusere frekvensen av klorid-celler i sekundære lameller i gjeller til pre-voksne anadrome fisk omfatter tilsetning av en PVCR-modulator til ferskvannet i en mengde tilstrekkelig til å modulere ekspresjon og/eller sensitivitet av minst én PVCR; og tilsetning av for for fiskekonsum til ferskvannet, hvor foret inneholder en mengde av NaCI tilstrekkelig til bidra til et betydelig øket nivå av PVCR-modulator i serum til den pre-voksne anadrome fisk. En økning i Na+ K+ ATPase aktivitet i klorid-celler og/eller en reduksjon av antallet klorid-celler i sekundære lameller forekommer, sammenlignet med fisk av samme størrelse og aldersgruppe holdt i ferskvann og ikke underkastet trinnene beskrevet heri. Et forhold av fordeling av klorid-celler mellom sekundær lamell (SL) og primær lamell (PL) kan bestemmes. SL/PL-forholdet reduseres, sammenlignet med fisk holdt i ferskvann og ikke underkastet trinnene ifølge foreliggende oppfinnelse. SL/PL-forholdet reduseres til nær å ligne forholdet oppvist av fisk allerede overført til sjøvann, mens den behandlede fisk fortsatt blir holdt i ferskvann. SL/PL-forholdet kan være i området mellom ca. 0,1 og ca. 1,0.Det er mulig å uføre deteksjonsforsøk eller metoder for bestemmelse av hvorvidt pre-voksne anadrome fisk som blir underkastet minst én PVCR-modulator og blir matet med for som har mellom ca. 1% og ca. 10% NaCI etter vekt, er klare for overføring til sjøvann, ved bedømmelse av mengden og/eller lokaliseringen av PVCR-ekspresjon i den pre-voksne anadrome fisk. Et modulert (f.eks. øket eller redusert) ekspresjonsnivå og/eller sensitivitet, sammenlignet med en kontroll (f.eks. PVCR-ekspresjon fra fisk ikke underkastet en PVCR-modulator), indikerer at den pre-voksne anadrome fisk er klar for overføring til sjøvann.I enda en annen utførelsesform angår foreliggende oppfinnelse anvendelse av et for for konsumpsjon av anadrome fisk i ferskvann for anvendelse i fremgangsmåten ifølge krav 1, hvor foret omfatter: a) én eller flere kilder av ernæring; b) en mengde av NaCI mellom ca. 10.000 mg/kg og ca. 100.000 mg/kg; og c) minst én PVCR-modulator;hvor foret modulerer ekspresjon og sensitivitet av minst én PVCR.Overraskende er det oppdaget at modulert ekspresjon og/eller endring av sensitiviteten av PVCR tillater at disse pre-voksne anadrome fisk bedre tilpasser seg til sjøvann. Inntil oppdagelsen ifølge foreliggende oppfinnelse var akvakulturindustrien ute av stand til å overføre de pre-voksne anadrome fisk til sjøvann uten å utsette fisken for stress, død og/eller sykdom. I motsetning til denne praksis modulerer utføring av trinnene ifølge foreliggende oppfinnelsen ekspresjonen og/eller endrer sensitiviteten av PVCR og tillater overføring av de pre-voksne anadrome fisk til sjøvann med minimalt eller intet stress, død og/eller sykdom og tilveiebringer uventet mange fordeler, så som øket vekst og evne til å overføre disse fisk til vann som har høyere temperaturer, som videre beskrevet her. Foreliggende oppfinnelse resulterer i én eller flere av de følgende fordeler ved overføring av pre-voksne anadrome fisk til sjøvann: en reduksjon i dødelighet; forbedring i foring; en økning i vekst; en reduksjon i mengden av syk fisk; og/eller en reduksjon av osmotisk sjokk. Det tillates også tidligere høsting av fisken med øket fleksibilitet i å produsere fisk året rundt og resulterer i betydelige kostnadsbesparelser for fiskeoppdrettsanlegg.Figur 1 er et diagram som illustrerer de partielle nukleotid- (SEKV ID NR:1) og aminosyre- (SEKV ID NR:2) sekvenser av polyvalent cation-sensing receptor (PVCR) av Atlantisk laks { Salmo salat). Figur 2 er et diagram som illustrerer de partielle nukleotid- (SEKV ID NR:3) og aminosyre- (SEKV ID NR:4) sekvenser av PVCR av arktisk røye ( Salvelinus alpinus). Figur 3 er et diagram som illustrerer de partielle nukleotid- (SEKV ID NR:5) og aminosyre- (SEKV ID NR:6) sekvenser av PVCR av regnbueørret ( Onchorhynchus my kiss). Figurer 4A-B er diagrammer som illustrerer oppstillingen av aminosyre-sekvensene for hainyre-kation-reseptor ("SKCaR") (SEKV ID NR: 18), laks (SEKV ID NR:2), arktisk røye (SEKV ID NR:4) og regnbueørret (SEKV ID NR:6). Figur 5 er et skjematisk diagram som illustrerer industripraksis for laks akvakultur-produksjon, før oppdagelsen ifølge foreliggende oppfinnelse. Diagrammet viser nøkkeltrinn i lakseproduksjon for SO (75 gram) og S1 (100 gram) smolt. Det bølgede symbol indikerer ferskvann mens boblene indikerer sjøvann. Figur 6A er en grafisk representasjon av sammenligning av det ukentlige forkonsum på en pr. fisk basis mellom Prosess I behandlede smolt som veier omtrent 76,6 gm mot industristandard smolt som veier omtrent 95,8 gm. Disse data er avledet fra individuelle nettmerder av fisk inneholdende ca. 10,000-50,000 fisk pr. merd. Som vist oppbrukte fisk behandlet med Prosess I omtrent to ganger så meget for pr. fisk under deres først uke etter sjøvannsoverføring sammenlignet med storindustri-standard smolt ukentlig matkonsum etter 30 dager. Figur 6B er en grafisk representasjon som illustrerer lengde (cm) og vekt (g) av APS Prosess I smolt 50 dager etter hav-merd plassering. APS Prosess I smolt hadde en gjennomsnittsvekt på 76,6 gram når plassert i sjøvann og det ble tatt prøver etter 50 dager. APS Prosess I er definert i Eksempel 2. Figur 7 er en grafisk representasjon som illustrerer lengde (cm) og vekt (g) av representative APS Prosess I smolt før overføring til sjøvann. Figur 8 er en grafisk representasjon som illustrerer lengde (cm) og vekt (g) av APS Prosess I smolt før overføring og mortalitet. Figur 9 er en tredimensjonal kurve som illustrerer overlevelse over 5 dager av Arktisk røye i sjøvann etter å være holdt i ferskvann, APS Prosess I i 14 dager og APS Prosess I i 30 dager. Figur 10 er en grafisk representasjon som illustrerer lengde (cm) og vekt (g) av St. John/St. John APS Prosess II smolt før sjøvannsoverføring. APS Prosess II er definert i Eksempel 2. Figurer 11A og 11B er grafiske representasjoner som illustrerer vekt (g) og lengde (cm) av APS Prosess II smolt overlevelse og dødelighet 5 dager etter overføring til sjøvannstanker og 96 timer etter overføring til sjømerder. Figur 12 er en grafisk representasjon som viser vekt (g) og lengde (cm) av APS Prosess II smolt mortalitet etter 5 dager etter overføring til sjømerder. Figurer 13A-G er fotografier av immunocytokjemi av epiteler av den proksimale tarm av atlantisk laks som illustrerer PVCR-lokalisering og ekspresjon. Figur 14 er et fotografi av Western Blot av intestinalt vev fra laks underkastet APS Prosess I for immun (spor markert CaR, f.eks. PVCR) og preimmun (spor markert preimmun) illustrerende PVCR-ekspresjon. Figur 15 er et fotografi av Western Blot av intestinalt vev fra unge ørret for immun (spor markert CaR, f.eks. PVCR) og preimmun (spor markert preimmun) illustrerende PVCR-ekspresjon. Figurer 16A-H er fotografier av immunocytokjemi av epitel fra proksimal tarm av regnbueørret ved anvendelse av anti-PVCR-antiserum illustrerende PVCR-lokalisering og -ekspresjon. Figur 17 er et fotografi av en Western Blot-sammenligning av nivåer av PVCR i fisk i ferskvann, vann som har kalsium og magnesium og sjøvann, som illustrerer PVCR-ekspresjon. Figurer 18A-C er fotografier av immunolokalisering av PVCR i epidermis til laks som illustrerer PVCR-lokalisering og -ekspresjon. Figur 19 er en skjematisk tegning som illustrerer adaptive endringer av fisk i sjøvann og i ferskvann. Figur 20 er en grafisk representasjon av serum-kalsiumkonsentrasjoner (mM) over tid i regnbueørret underkastet overføring til enten sjøvann eller vannblanding ifølge foreliggende oppfinnelse. Alle datapunkter representerer minst 5 uavhengige bestemmelser gjennomsnitt + standard avvik fra et enkelt representativt forsøk. Figur 21 er en grafisk representasjon som viser økninger i serum-kalsiumkonsentrasjoner (mM) over tid fremkalt ved foring av ørret holdt i en vannblanding (3mM kalsium, 1mM magnesium) og en standard ferskvann pelletert diett inneholdende ytterligere 1% natriumklorid (vekt/vekt). Figurer 22A og 22B er grafiske representasjoner av endringer i serum-kalsium (Figur 22A) og natrium (Figur 22B) etter sjøvannsoverføring av S1 Altantisk laksesmolt. Figurer 23A og B er grafiske representasjoner av serum kalsium-, magnesium- og natrium-nivåer (mM) over tid fra atlantisk laks S1 APS Prosess I behandlet fisk. Hver verdi viser gjennomsnitt +/- S.D. av et minimum på 10 uavhengige bestemmelser fra dette enkle representative forsøk. Figur 24 er en grafisk representasjon som illustrerer vekten (g) og lengden (cm) av representative APS Prosess II smolt før overføring til sjøvann. Denne representative prøve (n=100) av APS Prosess II smolt har et bredt område av kroppsvekter (3,95-23 gram) med en gjennomsnittlig kroppsvekt på 11,5 g. Bemerk at alle mortaliteter (n=10) bare skjedde bare i den mindre fisken i overføringsgruppen. Figur 25 er en grafisk representasjon som illustrerer kvantifisering av serum-konsentrasjoner (mM) av kalsium, magnesium og natrium i pre-voksne Atlantiske laks underkastet APS Prosess II etter deres overføring til sjøvann. Alle verdier vist er gjennomsnitt + S.D. av et minimum av 10 uavhengige prøver fra et enkelt representativt forsøk. Figurer 26A-C er en oppstilling som illustrerer nukleinsyresekvenser for PVCR fra atlantisk laks (SEKV ID NR.: 1), røye (SEKV ID NR.: 3), Chum-laks (SEKV ID NR.:7), Coho-laks (SEKV ID NR.:9), kongelaks (SEKV ID NR.:11), Pink laks (SEKV ID NR.:13 ), Sockeye laks (SEKV ID NR.:15) og ørret (SEKV ID NR.: 5). Figurer 27A-B er en oppstilling som illustrerer den åpne leseramme til polypeptid-sekvensene for PVCR av atlantisk laks (SEKV ID NR.: 2), røye (SEKV ID NR.: 4), Chum-laks (SEKV ID NR.: 8), Coho-laks (SEKV ID NR.: 10), kongelaks (SEKV ID NR.: 12), Pink laks (SEKV ID NR.: 14), Sockeye laks (SEKV ID NR.: 16) og ørret (SEKV ID NR.: 6). Figurer 28A-E er et diagram som illustrerer nukleinsyre- og aminosyresekvensen av SKCaR (henholdsvis SEKV ID NR.: 17 og 18). Figur 29 er en grafisk representasjon som viser antallet mortaliteter over dager 1-4 etter overføring til sjøvann av APS Prosess II fisk eksponert for kontinuerlige eller diskontinuerlige fotoperioder før og etter overføring til sjøvann. Figur 30 er en grafisk representasjon som viser lengden (cm) og vekten (g) av unge atlantiske laks eksponert for ferskvann (FW) eller APS Prosess II i et 6 ukers intervall. Figur 31 er en grafisk representasjon som viser kroppsvekt (g) og lengde (cm) sb APS Prosess II fisk-mortaliteter under 20-60 dager etter overføring til sjøvann. Figur 32 er en grafisk representasjon som viser GF3 (SGR normalisert for variasjon i vanntemperatur), SGR (spesifikke vekstforhold) og FCR (for-omdannelse-forhold) for fisk i intervaller 1-5 etter sjøvann-plassering. Figur 33 er en grafisk representasjon som viser kroppsvekt (g) og lengde (cm) av APS Prosess II fisk etter overføring til sjøvann-laboratorietanker. Figur 34 er en grafisk representasjon som viser SGR over 30 dagers intervaller av medium (40 g) og små (20 g) unge laks etter vekst i ferskvann (FW-kontroll) eller vekst etter å være underkastet APS Prosess II og overføring til sjøvann (APII-SW). Figur 35 er en grafisk representasjon som viser kroppsvekt (g) og lengde (cm) av parr dyrket i ferskvann (fylte ruter) og APS Prosess II fisk dyrket i sjøvann (åpne sirkler) som begge veier 20 g ved plassering og utført i et intervall på 62 dager. Figur 36 er en grafisk representasjon som viser kroppsvekt (g) og lengde (cm) av parr dyrket i ferskvann (fylte triangler) og APS Prosess II fiskdyrket i sjøvann (åpne kvadrater) som begge veier 40 g ved plassering og dyrket i et intervall på 62 dager.Figur 37 er en grafisk representasjon som viser FCR over intervaller på 30 dager av parede medium (40 g) og små (20 g) unge laks etter vekst i enten ferskvann (FW-Kontroll) eller sjøvann etter behandling med APS Prosess IIFigur 38 er en grafisk representasjon som viser forkonsum (% kroppsvekt/dag) over 61 dager for parede 20 g unge laks holdt i enten FW eller SW etter behandling med APS Prosess II. Figur 39 er en grafisk representasjon som viser forkonsum (% kroppsvekt/dag) over 61 dager for parede 40 g unge laks holdt i enten FW eller SW etter behandling med APS Prosess II. Figurer 40A-B er grafiske representasjoner som viser kroppsvekt (g) og lengde (cm) av laks som var underkastet enten APS Prosess I (Figur 40A) eller APS Prosess II (Figur 40B). Hver gruppe (n=60) av fisk ble målt umiddelbart før overføring til sjøvann (fylte ruter) og etter 37 dager av sjøvanns-opphold (åpne kvadrater). Figur 41 er en grafisk representasjon som viser SGR av mindre (gjennomsnittlig vekt 76,6 g) atlantiske laksesmolt behandlet med APS Prosess I eller større industristandard smolt (gjennomsnittlig vekt. 95,8 g) etter sjøvanns-overføring. Bemerk større SGR av APS Prosess I fisk under intervallet umiddelbart etter sjøvannsoverføring til tross for det faktum at kontrollfisk var overført til sjøvann 64 dager tidligere. Figur 42 er en grafisk representasjon som viser kroppsvekt (g) og lengde (mm) av laks underkastet APS Prosess I og overført til sjøvann. Figur 43 er en grafisk representasjon som viser kroppsvekt (g) og lengde (cm) av industristandard smolt (vist i fylte røde ruter) og smolt behandlet med APS Prosess I (vist i blå åpne kvadrater) etter vekst i sjømerder. Bemerk at APS smolt både begynte som mindre fisk og ble plassert i sjøvann 64 dager etter de tilsvarende kontrollsmolt. Figur 44 er en grafisk representasjon som viser kroppsvekt (g) og lengde (cm) av APS Prosess I fisk på tidspunktet for overføring til sjøvann sammenlignet med 61 dager etter vekst i sjøvann holdt på fuktig (38% fuktighets-innhold) for. Figur 45 er en grafisk representasjon som viser prosent (%) dødelighet observert i 6 grupper av unge atlantiske laks under 72 timer etter overføring til sjøvann. Hver gruppe mottok forskjellige for-additiver og ble holdt i enten ferskvann (kontroll) eller APS-vann-blanding inneholdende 3mM Ca 2+ og 1 mM Mg2+ i 2 ukers intervall før sjøvannsoverføring. Figur 46 er en grafisk representasjon som kvantifiserer enzymbundet immunosorbent-forsøk- (ELISA) protein (ng) for forskjellige vevprøver (f.eks. gjelle, lever, hjerte, muskel, mage, olf. epitel, nyre, urinblære, hjerne, hypofyse, lukte-kolbe, pylorisk ceacae, proksimal tarm og distal tarm) fra en enkelt fisk. Figur 47 er et fotografi av en revers transkriptasepolymerasekjedereaksjon- (RT-PCR) amplifisering av et partielt PVCR mRNA-transkript fra forskjellige vev (gjeller, nasale lameller, urinblære, nyre, tarm, mage, lever og hjerne) av atlantisk laks. RT-PCR reaksjoner ble separert ved gelelektroforese og enten merket i etidiumbromid (EtBr) eller overført til en membran og Southern blottet (SB) ved anvendelse av et 32P-merket 653 bp genomisk DNA-fragment fra atlantisk laks PVCR-gen. Figur 48 er en grafisk representasjon av forholdet av immunoreaktive celler (Na+/K+ ATPase) i sekundære lameller til primære lameller av fisk i ferskvann, APS Prosess II behandlet fisk i ferskvann og fisk i sjøvann. Figur 49 er en grafisk representasjon av Na+Ka+ ATPase-aktivitet til homogenater fra gjelle eller pylorisk caeca fremstilt fra unge laks holdt i enten ferskvann eller etter APS Prosess ll-behandling. Figur 50 er en grafisk representasjon av Na+Ka+ ATPase-aktivitet (urnol ADP/mg protein/h eller (3-aktin mRNA-forhold) av homogenater fra gjeller tii fisk holdt i ferskvann eller sjøvann. Figur 51 er en grafisk representasjon av forholdet fra FURA-2 celler som uttrykker PVCR i nærvær eller fravær av 10 mM L-isoleucin i forskjellige konsentrasjoner (0,5, 2,5, 5,0, 7,5,10,0 og 20,0 mM) av ekstracellulær kalsium (Ca2+). Figur 52 er en grafisk representasjon av fraksjonen Ca2+ respons, sammenlignet med ekstracellulær Ca2+ (mM) for bare PVCR i Ca2+, fenylalanin, isoleucin eller AA-blanding (L-isomerer i de følgende konsentrasjoner i mikromol/liter: 50 fenylalanin (Phe), 50 tryptofan (Trp), 80 histidin (His), 60 tyrosin (Tyr), 30 cystin (Cys), 300 alanin (Ala), 200 treonin (Thr), 50 asparagin (Asn), 600 glutamin (Gin), 125 serin (Ser), 30 glutaminsyre (Glu), 250 glycin (Gly), 180 prolin (Pro), 250 valin (Val), 30 metionin (Met), 10 asparaginsyre (Asp), 200 lysin (Lys), 100 arginin (Arg), 75 isoleucin (Ile), 150 leucin (Leu)).Foreliggende oppfinnelse angår fremgangsmåter for å forbedre oppdrett av pre-voksne anadrome fisk. Fremgangsmåtene involverer modulering av ekspresjon og/eller endring av sensitivitet av en Polyvalent Cation Sensing Receptor (PVCR) (f.eks. minst én PVCR). Modulering av ekspresjonen av PVCR påvirker fiskens evne til å tilpasse seg til sjøvann, til å gjennomgå smoltifisering, til å overleve, til å øke vekst, til å øke matkonsum og/eller til å være mindre mottagelig for sykdom.Spesielt omfatter fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse tilsetning av minst én PVCR-modulator til ferskvannet og tilsetning av et spesielt fremstilt eller modifisert for til ferskvannet for konsum av fisken. Foret inneholder en tilstrekkelig mengde av natriumklorid (NaCI) (f.eks. minst ca. 1% eller ca. 10,000 mg/kg til ca. 100,000 mg/kg) til betydelig å øke nivåer av PVCR-modulator i serumet. Denne mengden av NaCI i foret forårsaker eller induserer den pre-voksne anadrome fisk til å drikke mer ferskvann. Siden ferskvannet inneholder en PVCR-modulator og fisken inntar økede mengder av det, øker serumnivået av PVCR-modulatoren betydelig i fisken og forårsaker modulert (f.eks. øket og/eller redusert) PVCR-ekspresjon og/eller endret PVCR-sensitivitet. Denne prosessen tillater den pre-voksne anadrome fisk å prepareres for overføring til sjøvann, slik at de kan bedre kan tilpasse seg til sjøvann når de blir overført.Anadrome fisk er fisk som svømmer fra sjøvann til ferskvann for forplantning. Anadrome fisk omfatter for eksempel laks (for eksempel atlantisk laks ( Salmo salar), Coho laks ( Oncorhynchus kisutch), Chum laks { Oncorhynchus keta), Chinook laks ( Oncorhynchus tshawytscha), Pink laks ( Oncorhynchus gorbuscha), Sockeye laks ( Oncorhynchus nerka)), røye (f.eks. arktisk røye ( Salveninus alpinus)) og ørret (f.eks. regnbueørret ( Oncorhynchus mykiss)). Anadrome fisk omfatter også fisk som er ute av stand til å svømme til sjøvann (f.eks. innestengt av land), men har de fysiologiske mekanismer til å tilpasse seg til sjøvann. Betegnelsen "pre-voksne anadrome fisk," som anvendt her, angir anadrome fisk som ennu ikke er tilpasset sjøvann. Disse fisk er generelt unge fisk. Pre-voksne anadrome fisk omfatter, men er ikke begrenset til fisk som er unglaks, parr eller smolt. Som anvendt her er "smolt" en fisk som gjennomgår fysiologisk endringer som tillater fisken å tilpasse seg til sjøvann eller overleve ved påfølgende overføring til sjøvann. Betegnelsen "smolt" angir også en fisk som ikke er på det nøyaktige utviklingsstadium som kan overleve uskadet ved overføring til sjøvann, men heller er én av en populasjon av fisk hvor, basert på en statistisk prøvetagning og evaluering, hvor populasjonen av fisk blir funnet å være på et fysiologisk stadium klart for overføring til sjøvann.Pre-voksne anadrome fisk som gjennomgår moltifiseringsprosessen prepareres for overføring til sjøvann. Smoltifisering er det stadium ved hvilket en fisk gjennomgår akklimatisering eller tilpasning fra ferskvann til sjøvann. Smoltifisering angir også en prosess som skjer i pre-voksne anadrome fisk som er fysiologisk en forhåndstilpasning til sjøvann mens de fortsatt er i ferskvann. Smoltifiserings-prosessen varierer fra arter til arter. Forskjellige arter av anadrome fisk kan gjennomgå smoltifisering ved forskjellig størrelse, vekt og tid i livet til fisken. Foreliggende oppfinnelse induserer at den store majoritet eller alle de pre-voksne anadrome fisk gjennomgår denne prosessen og prepareres for overføring til sjøvann.Den pre-voksne anadrome fisk blir holdt i ferskvann før tilsetning av PVCR-modulator. Betegnelsen "ferskvann" betyr vann som kommer fra for eksempel en bekk, elv, tjern, offentlig vannforsyning eller fra andre ikke-marine kilder som for eksempel har den følgende ioniske sammensetning: mindre enn ca. 2 mM magnesium, kalsium og NaCI. Betegnelsen "ferskvann" angir også ferskvann til hvilket minst én PVCR-modulator er tilsatt, som beskrevet her.PVCR-modulatoren blir satt til ferskvannet i tilstrekkelige mengder til å modulere ekspresjon eller endre sensitivitet av PVCR. PVCR blir isolert fra forskjellige vev fra mange typer av anadrome fisk ved anvendelse av molekylære biologiteknikker, som beskrevet i Eksempel 9. DNA ble isolert fra prøver fra forskjellige arter av anadrome fisk omfattende atlantisk laks, røye, Chum laks, Coho laks, King eller Chinook laks, Pink Laks, Sockeye laks og ørret. Se Eksempel 20 som viser at PVCR er uttrykt i vev som vist ved RT-PCR. DNA ble amplifisert ved anvendelse av polymerasekjedereaksjon-(PCR) metodikk. Det amplifiserte DNA ble renset og subklonet inn i vektorer og deres sekvenser ble bestemt, som beskrevet i Eksempel 9.PVCR, som er lokalisert i forskjellige vev (f.eks. gjelle, skinn, lukte-lameller, tarm, nyre, urinblære, hjerne eller muskel) av de pre-voksne anadrome fisk, føler endringer i PVCR-modulatorer omfattende forskjellige ioner (f.eks. divalente kationer), for eksempel i det omgivende vann, i deres serum eller i det luminale innhold av tubuler inne i kroppen, så som nyre, urinblære eller tarm. Dens evne til å føle disse modulatorer øker og/eller reduserer ekspresjon av PVCR, og lar derved fisken bedre tilpasses til sjøvann. Øket og/eller redusert ekspresjon av PVCR kan for eksempel forekomme i ett eller flere vev eller i alle vev.En "PVCR-modulator" er definert her å bety en forbindelse som modulerer (f.eks. øker og/eller reduserer) ekspresjon av PVCR eller endre sensitivitet eller mottagelighet for PVCR. Slike forbindelser omfatter, men er ikke begrenset til, PVCR-agonister (f.eks. uorganiske polykationer, organiske polykationer og aminosyrer), Type II kalsimimetika og forbindelser som indirekte endrer PVCR-ekspresjon (f.eks. 1,25 dihydroksyvitamin D i konsentrasjoner på ca. 3000 -10.000 Internasjonale enheter/kg for), cytokiner så som interleukin-beta og makrofag kjemotaktisk peptid-1 (MCP-1)). Eksempler på Type II kalsimimetika, som øker og/eller reduserer ekspresjon og/eller sensitivitet av PVCR, er for eksempel NPS-R-467 og NPS-R-568 fra NPS Pharmaceutical Inc., (Salt Lake, Utah, Patent nr. 5,962,314; 5,763,569; 5,858,684; 5,981,599; 6,001,884) som kan administreres i konsentrasjoner på mellom ca. 0,1 uM og ca. 100 uM for eller vann. Se Nemeth, E.F. et al., PNAS 95: 4040-4045 (1998). Eksempler på uorganiske polykationer er divalente kationer omfattende kalsium i en konsentrasjon mellom ca. 2,0 og ca. 10,0 mM og magnesium i en konsentrasjon mellom ca. 0,5 og ca. 10,0 mM; og trivalente kationer omfattende, men ikke begrenset til, gadolinium (Gd3+) i en konsentrasjon mellom ca. 1 og ca. 500 u.M. Organiske polykationer omfatter, men er ikke begrenset til, aminoglykosider så som neomycin eller gentamicin i konsentrasjoner på mellom ca. 1 og ca. 8 g/kg for så vel som organiske polykationer omfattende polyaminer (f.eks. polyarginin, polylysin, polyhistidin, polyornitin, spermin, cadaverin, putrescin, kopolymerer av polyarginin/histidin, polylysin/arginin i konsentrasjoner på mellom ca. 10 u.M og 10 mM for). Se Brown, E.M. et al., Endocrinology\ 28: 3047-3054 (1991); Quinn, S.J. et al., Am. J. Physiol. 273: C1315-1323 (1997). I tillegg omfatter PVCR-agonister aminosyrer så som L-tryptofan L-tyrosin, L-fenylalanin, L-alanin, L-Serin, L-arginin, L-histidin, L-leucin, L-isoleucin, L-asparaginsyre, L-glutaminsyre, L-glycin, L-lysin, L-metionin, L-asparagin, L-prolin, L-glutamin, L-treonin, L-valin og L-cystein i konsentrasjoner på mellom ca. 1 og ca. 10 g/kg for. Se Conigrave, A.D., et al., PNAS 97: 4814-4819 (2000). Aminosyrer er, i én utførelsesform, også definert som de aminosyrer som kan merkes av minst én PVCR i nærvær av lave nivåer av ekstracellulær kalsium (f.eks. mellom ca. 1 mM og ca. 10 mM). I nærvær av ekstracellulær kalsium kan PVCR i organer eller vev så som tarm, pylorisk caeca eller nyre bedre merke aminosyrer. Se Eksempel 22. De molare konsentrasjoner refererer til frie eller ioniserte konsentrasjoner av PVCR-modulator i ferskvannet og omfatter ikke mengder av bundet PVCR-modulator (f.eks. PVCR-modulator bundet til negativt ladede partikler omfattende glass, proteiner eller plastoverflater). Hvilken som helst kombinasjon av disse modulatorer kan tilsettes til vannet eller til foret (i tillegg til NaCI, som beskrevet her), så lenge kombinasjonen modulerer ekspresjon og/eller sensitivitet av PVCR.PVCR-modulator kan administreres til fisken på flere måter. Administrering av PVCR kan skje på hvilken som helst måte som er tilstrekkelig til å modulere ekspresjonen og/eller endre sensitiviteten av PVCR. PVCR-modulatoren kan bli satt til ferskvannet i forskjellige konsentrasjoner, som beskrevet her. Et ferskvannmiljø som har minst én PVCR-modulator er referert til her som et "PVCR-modulator-miljø." PVCR-modulatorer som blir satt til vannet, modulerer ekspresjon og/eller endrer sensitiviteten av PVCR på skinnet og gjellene av fisken og kan inntas av fisken, spesielt, når fisk blir matet med for som har mellom ca. 1% og ca. 10% NaCI (f.eks. i konsentrasjoner mellom ca. 10.000 mg/kg og ca. 100.000 mg/kg for). I tillegg til tilsetning av NaCI til foret, kan også PVCR-modulator (f.eks. en aminosyre så som tryptofan) være satt til foret. Mengder og typer av PVCR-modulatorer satt til foret er også beskrevet her. Andre utførelsesformer omfatter å utsette fisken for PVCR-modulatoren ved å "dyppe" fisken i modulatoren, f.eks. organiske polykationer. De organiske polykationer kan formuleres på en slik måte at polykationene tillates å adhere til huden og gjellene til fisken, i tilstrekkelige mengder til å modulere ekspresjon av PVCR.I én foretrukket utførelsesform blir foreliggende oppfinnelse praktisert ved tilsetning av en kombinasjon av to PVCR-agonister til ferskvannet. Spesielt blir kalsium og magnesium satt til ferskvannet for å bringe konsentrasjonene av hver til mellom ca. 2,0 mM og ca. 10,0 mM kalsium og mellom ca. 0,5 mM og ca. 10,0 mM magnesium. I tillegg til tilsetning av kalsium og magnesium til vannet, kan disse områder av ionekonsentrasjoner oppnås ved å tilveiebringe brakkvann- (f.eks. fortynnet sjøvann) miljø for fisken.Kalsium og magnesium kan komme fra en rekke kilder, som når satt til vannet, kalsium- og/eller magnesium-nivåene modulerer ekspresjon av PVCR og/eller er innen de angitte områder. Kilder for kalsium og magnesium kan være en blanding av en rekke forbindelser eller hver kan komme fra en hovedsakelig ensartet eller ren forbindelse. Kilder for kalsium omfatter for eksempel Ca(C03)2> CaCI2,CaS04 og Ca(OH)2 og kilder for magnesium omfatter for eksempel MgCI2, MgS04, MgBr2 og MgC03.Periodisk (f.eks. avbrutt) så vel som kontinuerlig (f.eks. uavbrutt) eksponering for ferskvann som har minst én PVCR-modulator, mens på NaCI-diett kan utføres. Periodisk eksponering for PVCR kan skje så lenge PVCR-ekspresjon og/eller endret sensitivitet forblir modulert (f.eks. øket og/eller redusert i forskjellige vev). Kontinuerlig oppbevaring i eller eksponering for ferskvann som har minst én PVCR-modulator er vist i Eksempler 2 og 7.Fisken prepareres for overføring fra ferskvann til sjøvann. Den pre-voksne anadrome fisk blir holdt i et ferskvannmiljø som har en PVCR-modulator lenge nok til å modulere ekspresjonen og/eller endre sensitiviteten av PVCR. Lengden av tid avhenger av den fysiologiske og fysiske modenhet av fisken. Noen fisk vil lettere tilpasse seg til omgivelsene og modulere deres ekspresjon og/eller endre sensitivitet av deres PVCR, mens andre vil trenge mer tid for dette. Faktorer som kan innvirke på lengden av tid nødvendig for å modulere ekspresjonen og/eller endre sensitiviteten av PVCR omfatter, men er ikke begrenset til, størrelse av fisken, nivå av PVCR-ekspresjon eller - sensitivitet, hvis noen, før tilsetning av PVCR-modulator til ferskvannet, fiskens evne til å utskille PVCR-modulator og ioner, fiskens overflate til volum forhold, etc. Derfor kan lengden av tiden fisken blir holdt være i området fra ca. 7 dager til mange måneder (f.eks. 7,14, 21, 30, 45, 90 og 120 dager). Fisken kan også holdes i ubestemt tid så lenge fisken blir holdt i ferskvann som har PVCR-modulator og blir matet med en NaCI-diett. For eksempel kan laks, ørret eller røye som veier mindre enn 10 g holdes i ferskvann som har en PVCR-modulator og blir matet en NaCI-diett i minst ca. 180 dager, før overføring til sjøvann.Oppfinnelsen omfatter videre tilsetning av for til ferskvannet. Hyppigheten og mengdene av for som fisken blir matet med, er kjent på området. Generelt blir fisken matet 1-3 ganger pr. dag, totalt ca. 0,25-5,0% kroppsvekt/dag. Foret har nok NaCI til å bidra til et betydelig øket nivå av PVCR-modulator i serumet til den pre-voksne anadrome fisk. Mer spesifikt har NaCI minst to effekter. Den første forekommer når tilstrekkelige mengder av NaCI er til stede i foret. Tilstedeværelsen av NaCI i foret forårsaker at den pre-voksne anadrome fisk drikker mer vann fra omgivelsen rundt. For det andre er NaCI en direkte negativ PVCR-modulator og virker til å redusere PVCR-sensitivitet. Til tross for NaCIs effekt til å redusere sensitivitet, øker overraskende PVCR-ekspresjon i visse vev når fisk blir matet med en NaCI-diett og det omgivende ferskvannsmiljø har minst én PVCR-modulator deri. Økningen i inntaket av ferskvann som har PVCR-modulatorer forårsaker en total økning av serumnivåene av PVCR-modulatorer.For inneholdende NaCI blir referert til her som "NaCI-dietter." NaCI kan kombineres eller erstattes med andre natriumsalter for å bidra til den ønskede effekt av øket PVCR-ekspresjon, endring av PVCR-sensitivitet og/eller som medfører at fisken drikker mer. Således, som anvendt her, omfatter betegnelsen NaCI en hovedsakelig ren forbindelse, blandinger av NaCI med andre kilder for natrium og blandinger av andre kilder for natrium. Foret kan videre omfatte en PVCR-modulator og spesielt en PVCR-agonist så som en aminosyre. I én utførelsesform omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte ifølge krav 9, hvor nevnte PVCR-modulator inneholdt i foret omfatter en aminosyre. Tryptofan kan være tilstede i en mengde mellom ca. 1 og ca. 10 g/kg. I tillegg til de unike komponenter ifølge foreliggende oppfinnelse som omfatter foret, som beskrevet ovenfor, kan foret i tillegg omfatte bestanddeler som tradisjonelt blir satt til for, f.eks. for ernæring og/eller palatalisering. For eksempel kan foret omfatte fiske-komponenter, så som flyndre- eller blekksprutkjøtt eller fiskeoljer.Foret kan fremstilles på flere måter, så lenge den riktige konsentrasjon av NaCI er til stede. Foret kan for eksempel fremstilles ved reformulering av foret eller ved å la foret absorbere en løsning som inneholder NaCI og eventuelt, tilsetning av en PVCR-modulator. Et overflatelag kan tilsettes for palatabilitet. Eksempel 8 beskriver i detalj én måte for fremstilling av foret.Pre-voksne anadrome fisk kan fores med for som har minst 1% NaCI etter vekt når fisken blir holdt i en ferskvannomgivelse som har mellom ca. 2,0 og ca. 10,0 mM kalsium og mellom ca. 0,5 mM og ca. 10,0 mM magnesium. Med dette øker nivåene av kalsium, magnesium og/eller natrium i serumet til den pre-voksne anadrome fisk, sammenlignet med identisk parede fisk holdt i ferskvann, mellom henholdsvis ca. 1% og 60%, mellom ca. 1% og 40% og mellom ca. 1% og 15 %.I en annen utførelsesform blir fisken, mens den er i ferskvannet som har PVCR-modulator, også eksponert for en fotoperiode. En fotoperiode angir eksponering av fisken for lys (f.eks. sollys, glødelys eller fluorescerende lys). Fortrinnsvis er fotoperioden hovedsakelig kontinuerlig eller skjer lenge nok til å øke vekst, fremkalle smoltifisering og/eller redusere dødelighet. Fisken kan utsettes for en kontinuerlig fotoperiode mens de er i ferskvann og gjennomgår trinnene ved foreliggende oppfinnelse (f.eks. i PVCR-modulator-omgivelse og matet med NaCI-diett), så vel som etter å være eksponert for denne omgivelse og deretter overføres til sjøvann. Fotoperioden kan vare i minst ca. 12 timer i løpet av et 24 timers intervall eller i lenger perioder så som ca. 14,16,18, 20, 22 eller fortrinnsvis, ca. 24 timer. Antallet dager fisken blir eksponert for en fotoperiode kan være i området fra ca. 1 dag til mange måneder (f.eks. 1,3,7, 14, 21, 30, 45, 90 og 120 dager). Fortrinnsvis er fotoperioden mens fisken blir holdt i PVCR-modulator-omgivelsen og blir matet med NaCI-diett, fortrinnsvis mellom ca. 4 dager og ca. 50 dager. Fisken kan også holdes slik i ubestemt tid så lenge fisken blir holdt i ferskvann som har PVCR-modulatoren og blir matet med en NaCI-diett. Etter overføring til sjøvann, er fotoperiode-eksponering fortrinnsvis mellom ca. 7 dager og ca. 45 dager. PVCR kan moduleres i en rekke vev omfattende stilken av pinealkjertelen. Metoder for eksponering av fisk for en fotoperiode er kjent på området og er beskrevet i for eksempel Willoughby, S., Manual of Salmonid Farming, Blackwell Scientific, Oxford, UK, 106 og 152-154 (1999).Fisken kan også eksponeres for en fotoperiode etter overføring til sjøvann. Virkningene av eksponering av fisk for en fotoperiode er beskrevet i Eksempel 10 og Tabell 13. Fordelene ved eksponering for en fotoperiode omfatter en dramatisk reduksjon i dødeligheten av fisk etter overføring til sjøvann. Således, i én utførelsesform, øker holding av fisken i en kontinuerlig fotoperiode, deres overlevelse under deres tilpasning til sjøvann.Etter eksponering for trinnene ifølge foreliggende oppfinnelse, blir den pre-voksne anadrome fisk overført til sjøvann. Betegnelsen "sjøvann" betyr vann som kommer fra sjøen eller vann som er formulert til å simulere den kjemiske og mineralske sammensetning av vann fra sjøen. Hoved-elementsammensetningen av det fremstilte sjøvann faller fortrinnsvis hovedsakelig innenfor området av hovedelement-sammensetningen av naturlig sjøvann (som f.eks. har den følgende ioniske sammensetning: over 30mM magnesium, over ca. 6 mM kalsium og over ca. 300 mM NaCI). Metoder for fremstilling av kunstig sjøvann er kjent på området og er beskrevet i for eksempel U.S. pat. nr. 5,351,651.Ved utføring av fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse på pre-voksne anadrome fisk, viser fisken betydelig øket vekst (f.eks. SGR), tarm-motilitet og/eller matkonsum, sammenlignet med pre-voksne anadrome fisk som ikke blir underkastet foreliggende oppfinnelse. Foreliggende oppfinnelse tillater forbedringer i vekst, tarmmotilitet og/eller matkonsum før, under og etter sjøvann-overføring. Ved overføring til sjøvann opplever fisk som ikke blir underkastet trinnene ifølge foreliggende oppfinnelse generelt osmotisk stress, redusert eller intet matkonsum og til og med død. Osmotisk stress resulterer fra forskjeller i det osmotiske trykket mellom det omgivende miljø og kroppskammere i fisken. Dette forstyrrer den homeostatiske likevekt i fisken og resulterer i redusert vekst, reproduktiv svikt og redusert resistens mot sykdom. Fisken som blir underkastet trinnene ifølge foreliggende oppfinnelse opplever ikke en betydelig mengde osmotisk stress og begynner spising ved eller raskt etter overføring til sjøvann. Som et resultat vokser fisken også raskere og når markedsstørrelse raskere. I ett forsøk begynte fisk underkastet APS Prosess I kraftig spising innen 48 timer etter overføring til sjøvann, sammenlignet med kontrollfisk (f.eks. fisk ikke underkastet APS Prosess I) som begynte spising 20 dager etter overføring til sjøvann. Disse fiskene er antatt å nå markedsstørrelse 7 måneder tidligere enn fisk ikke underkastet APS Prosess I. Se Eksempel 15. Spesielt viser pre-voksne anadrome fisk som inntok et for som har mellom ca. 1% og ca. 10% NaCI og mellom ca. 1 g og ca. 10 g pr. kg for av en aminosyre, en vesentlige økning i vekst etter overføring til sjøvann. I forsøkene har fisken underkastet trinnene ifølge foreliggende oppfinnelse vist så meget som ca. 65% øket vekst under samme tidsintervall, sammenlignet med identisk parede fisk som ikke gjennomgår trinnene ifølge foreliggende oppfinnelse og ble overført til sjøvann. Se Tabell 4 i Eksempel 2. I et annet forsøk hadde fisk underkastet APS Prosess I omtrent samme størrelse som kontrollfisk etter overføring til sjøvann, selv om kontrollfisk ble i sjøvann i ytterligere 64 dager og var 25% større på tidspunktet for sjøvannoverføring. Se Eksempel 15. Bemerkelsesverdige økninger i vekst ble også sett med APS Prosess II. I ett spesielt forsøk øket fisk behandlet med APS Prosess II raskt deres kroppsvekter mer enn 9 ganger (15,2 g til 142,5 g) under et visst 157-dagers intervall, en betydelig økning i vekst sammenlignet med kontrollfisk. Se Eksempel 12. I tillegg tillater foreliggende oppfinnelse økninger i vekst av fisk av en rekke størrelse. Vekstøkninger sees i mindre fisk (f.eks. ca. 15 g), medium fisk (f.eks. 40 g) så vel som større fisk (f.eks. 90-120 g). Se Eksempler 12 og 14. Følgelig angår foreliggende oppfinnelse metoder for å øke vekst av pre-voksne anadrome fisk som har vekter i et område fra ca. 15 g til ca. 120 g. Ekspresjon og/eller sensitivitet av PVCR kan moduleres, for eksempel i klorid-celler i gjellevev eller epitelceller i mavetarmkanalen (f.eks. mage, pylorisk caeca, proksimal eller distal tarm), tubuler i nyre, skinn eller urinblære.Eliminering av lav foring eller dårlig foring av osmotisk stresset fisk i en gruppe forbedrer også de totale for-omdannelses-forhold for hele gruppen. Optimal foring og vekst etter sjøvann-overføring av alle medlemmer av gruppen behandlede fisk vil tillate bedre forutnyttelse og forbedre det totale utbyttet av produksjon når fisken når markedsstørrelse.FCR blir forbedret for pre-voksne anadrome fisk som blir overført til sjøvann. For-omdannelses-forholdet eller FCR blir oppnådd ved å dividere kroppsvektøkningen av en gruppe fisk med mengden av mat matet til denne gruppe fisk. Jo mer effektiv omdannelsen av mat til kroppsvekt-vekst hos fisk, desto mindre er FCR (liten mengde av for/stor vektøkning av fisk). Et meget lite FCR-tall (mindre enn 1) omfatter en meget effektiv omdannelse av mat til kroppsvekt-vekst og er hva industrien streber etter. I motsetning betyr en stor FCR en ineffektiv omdannelse av mat til kroppsvektøkning og er generelt uønsket. Stor eller dårlig FCR er uønsket fordi for vanligvis er dyrt og mer må anvendes for å få fisken til å vokse til en gitt vekt. FCR-verdier for fisk underkastet metodene ifølge foreliggende oppfinnelse er generelt mindre og mer ønskelige, i noen tilfeller (f.eks. når fisk ble matet tørrfor), enn de fleste industri-publiserte verdier fordi foreliggende oppfinnelse eliminerer tilstedeværelse av osmotisk skadede fisk som tenderer til å øke total FCR siden de spiser for, men ikke vokser. Som en konsekvens, ved å underkaste fisken for metodene ifølge foreliggende oppfinnelse, reduseres FCR, i én utførelsesform, forderved å tillate optimal foring og vekst av nesten all fisken. FCR for fisk underkastet foreliggende oppfinnelse er tilstrekkelig til å opprettholde vekst og foring av majoriteten av fisk eller fortrinnsvis øke vekst og forkonsum av majoriteten av fisk. Når fisk blir underkastet metodene ifølge foreliggende oppfinnelse viser de områder av FCR, som for eksempel ville omfatter verdier mellom ca. 0,7 og ca. 7,0. Spesielt blir forkonsum eller forinntak forbedret fordi det er antatt at fisken "lukter" eller "føler" foret med PVCR i celler av lukte-lameller eller lukte-kolbe.Tilsvarende tillater foreliggende oppfinnelse nedsettelse eller reduksjon av tiden mellom generasjoner av pre-adult anadrom fisk. Disse fisk begynner forplantning tidligere fordi foreliggende oppfinnelse øker deres vekst, som beskrevet her. Siden 2-3 år er nødvendig for å oppnå seksuelt moden fisk, krever forsøk for selektiv foredling av trekk 2-3 års intervall før et gitt trekk kan selekteres og fisken viser det foredlede trekk. Forbedringer i vekst og tid for å nå modenhet frembragt ved oppfinnelsen reduserer tidsintervallet nødvendig for å oppnå seksuelt modne fisk med så meget som ca. 6 måneder til ca. 12 måneder. Reduksjon av intervallet for oppavling tillater produksjon av mer fisk og forbedret seleksjon av fisk som har andre trekk som er bedre i stand til å tilasse seg til sjøvann (f.eks. seleksjon av fisk som har forbedret smak, øket filet-tykkelse, øket 3 omega fettsyre-innhold eller fisk som er bedre i stand til å modulere PVCR-ekspresjon).Før foreliggende oppfinnelse ble anadrome fisk som blir overført fra ferskvann til sjøvann generelt overført i en spesiell størrelse, referert til som "kritisk størrelse." Den kritiske størrelsen varierer fra arter til arter, men angir generelt angir en minimumsstørrelse ved hvilken en fisk kan overføres til sjøvann. Den kritiske størrelsen for laks, ørret og røye er mellom henholdsvis ca. 50 og ca. 100 g, mellom ca. 70 og ca. 120 g og større enn 100 g. Kritiske størrelser for Coho-, King- og Sockeye-laks er mellom henholdsvis ca. 10 og ca. 15 g, mellom ca. 20 og 40 g og mellom ca. 1 og ca. 2 g. Chum- og Pink-laks har hver en kritisk størrelse på ca. mindre enn 3 g.Før oppfinnelsen ble en populasjon av pre-voksne anadrome fisk som har oppnådd en gjennomsnittlig kritisk størrelse overført til sjøvann. Noen av fiskene er fysiologisk klare for overføringen, mens andre ikke er det. Dette er én av grunnene for den økede dødelighetsgrad ved overføring til sjøvann. Metodene ifølge foreliggende oppfinnelse forbereder fysiologisk alle eller nesten alle fiskene for overføring til sjøvann ved å modulere PVCR-ekspresjon og/eller sensitivitet og/eller ved å fremkalle smoltifisering. Mer enn ca. 80%(f.eks. 90%, 95%, 100%) gjennomgår smoltifisering og er klare for overføring til sjøvann. I ett forsøk, ved utføring av trinnene ifølge foreliggende oppfinnelse på atlantisk laks (f.eks. underkaste fisken for en PVCR-modulator-omgivelse og en NaCI-diett), gjennomgikk faktisk nær 100% av den atlantiske laks smoltifisering. Se Eksempel 2. Således omfatter metodene ifølge foreliggende oppfinnelse metoder for preparering av pre-voksne anadrome fisk for overføring til sjøvann, så vel som som fremkalling av smoltifisering i pre-voksne anadrome fisk.Siden fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse modulerer ekspresjonen og/eller sensitiviteten av PVCR i pre-voksne anadrome fisk, overlever de bedre når de overføres til sjøvann. Redusert osmotisk stress resulterer i redusert dødelighet. I ett tilfelle viste visse populasjoner av pre-voksne anadrome fisk som ikke gjennomgikk metodene ifølge foreliggende oppfinnelse 100% dødelighetsgrad etter overføring til sjøvann (se Figur 9, Eksempel 2), mens andre populasjoner av pre-voksne anadrome fisk som ikke gjennomgikk metodene ifølge foreliggende oppfinnelse har overlevelsesgrader på bare mellom ca. 40% og 70% (f.eks. omtrent 50%). Se Tabell I, Eksempel 2. Dette skjer fordi fisken opplever osmotisk sjokk når overført til sjøvann som har en meget forskjellig ionisk sammensetning enn ferskvann. Når imidlertid underkastet metodene ifølge foreliggende oppfinnelse, viser fisken overlevelsesgrad som er betydelig større enn graden for ubehandlet fisk (f.eks.mellom ca. 80% ca. 100%). Ved anvendelse av foreliggende oppfinnelse på atlantisk laks overlever faktisk 99% av fisken overføring til sjøvann etter 5 dager, sammenlignet med 50% av fisk som ikke gjennomgikk trinnene ifølge foreliggende oppfinnelse i ett forsøk. Se Tabell I i Eksempel 2. Således omfatter foreliggende oppfinnelse metoder for reduksjon av dødelighetsgraden etter at pre-voksne anadrome fisk er overført til sjøvann.Ikke bare fører fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse til reduksjon av dødelighetsgrad etter overføring til sjøvann, fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse fører også til å øke overlevelsesgrad i ferskvann før overføring. Før oppdagelsen ifølge foreliggende oppfinnelse, eksisterte et "smolt vindu" klekkeriene overførte de pre-voksne anadrome fisk til sjøvann eller ellers døde fisken hvis de fortsatt forblir i ferskvann etter å ha gjennomgått smoltifisering. PVCR-modulator-omgivelsen og NaCI-dietten ifølge foreliggende oppfinnelse tillater fisken å fortsette å trives i ubestemt tid. Fisken fortsetter å konsumere for og vokse. Følgelig øker metodene ifølge foreliggende oppfinnelse betydelig tidsperioden eller "vinduet" hvor fisken kan overføres til sjøvann eller eliminere den helt. Når foreliggende oppfinnelse ble utført på atlantisk laks overlevde to trivdes 99% av fisken i minst 45 dager i ferskvann og øket derved smolt "vinduet" til minst ca. 45 dager (f.eks. 1-45 dager). I motsetning overlevde bare 67% av fisken som ikke gjennomgikk trinnene ifølge foreliggende oppfinnelse etter 45 dager i ferskvann i ett forsøk. Se Eksempel 2. I tillegg, etter at disse fisker er overført til sjøvann konsumerer de mer for og vokser bedre, sammenlignet med fisk som ikke gjennomgikk hverken APS Prosess I eller II, som ytterligere beskrevet her og spesielt, Eksempel 15.Pre-voksne anadrome fisk som har mindre vekt, sammenlignet med industri-fastsatt kritisk størrelse for de spesielle arter av fisk kan overføres til sjøvann. PVCR-ekspresjon moduleres i fisk som er mindre enn de normalt overført til sjøvann eller de som gjennomgår eller i ferd med å gjennomgå smoltifisering. Dette omfatter overføring av parr, stadiet av unge fisk før de blir smolt, til sjøvann. Parr er et livsstadium av pre-voksne anadrome fisk som forekommer etter modning av aleviner eller plommesekk-yngel. Parr eller fingerling har karakteristiske ovide striper eller parr-merker langs deres flanker og gjennomgår normalt vekst og utvikling i ferskvann før smoltifisering. Betegnelsen "parr" er en betegnelse som er kjent på området. Ettersom plommesekk-yngel fortsetter å spise, vokser de til større parr. Parr kan ha et bredt område av kroppsvekter avhengig av betingelsene under hvilke de blir dyrket. Vekten av parr varierer fra arter til arter. Kroppsvekter til parr variere betydelig innen et område fra ca. 0,5 g til ca. 70 g. Utførelse av ett forsøk, som beskrevet her, resulterer i en overføring av atlantisk laks parr som veier så lite som mellom ca. 13% og ca. 18,5% av den kritiske størrelsesvekt (mellom ca. 70 og ca. 100 g) eller ca. 13 g. Tilsetning av en PVCR-modulator til foret (f.eks. en aminosyre så som tryptofan), i tillegg til NaCI-dietten, tillater sjøvanns-overføring av fisk som har spesielt lav vekt. Se Eksempel 2.1 én utførelsesform kunne laks som var underkastet APS Prosess II overføres til sjøvann når den veiet så lite som 15 gram. Laks som veier minst 15 gram opplevet rask vekst, effektivt anvendt for og led mindre død enn laks som ikke var eksponert for APS Prosess II og veiet 4 ganger mer. Se Eksempel 12.Metodene nevnt ovenfor kan anvendes for overføring av pre-voksne anadrome fisk til sjøvann som har varmere temperaturer (f.eks. 14°C og 19°C), sammenlignet med vanntemperaturer (6°-14°C) til hvilke disse fisk er overført tidligere. Siden fisken opplever redusert eller lite osmotisk stress når overført til sjøvann ved anvendelse av metodene ifølge foreliggende oppfinnelse, kan fisken tåle overføring til høyere vanntemperaturer uten å få en økning i dødelighetsgrad. Se Eksempel 2.Fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse reduserer også forekomst av sykdom blant smolt og den voksende laks. Fordi smolt behandlet ved metodene ifølge foreliggende oppfinnelse opplever mindre stress ved overføring til sjøvann, er deres immune funksjoner sterkere og de er mindre mottagelig for parasittiske, virale, bakterielle og fungale sykdommer. Fisk som ikke er behandlet ved metodene beskrevet her er mer mottagelige for slike sykdommer og kan tjene som reservoirer for sykdom, som kan infisere frisk fisk.Distribusjon av klorid-celler i forskjellige vev av pre-voksne anadrome fisk kan modifiseres. Ett eksempel på et slikt vev er gjellevev. Imidlertid, i multiple forsøk hvor fisken ble underkastet APS Prosess II, skiftet distribusjonen av klorid-celler i gjellene slik at det ble en betydelig reduksjon i antallet klorid-celler i de sekundære lameller som ligner mønsteret vist av fisk overført til sjøvann selv om den behandlede fisk forble i ferskvann. I fisk holdt i ferskvann og ikke underkastet trinnene ifølge foreliggende oppfinnelse, er klorid-celler lokalisert i omtrent likt antall i både de primære og sekundære lameller av gjellevev. I motsetning, når slik fisk blir overført til sjøvann, endres fordelingen slik at betydelig færre klorid-celler er observert i sekundære lameller. Se Eksempel 21. Følgelig omfatter metodene ifølge foreliggende oppfinnelse økning av antallet klorid-celler i de primære lameller og reduksjon av antallet klorid-celler i de sekundære lameller ved å underkaste fisken for metodene beskrevet her. Lokalisering av klorid-celler kan utføres ved anvendelse av metoder kjent på området. Klorid-celler inneholder rikelige mengder av Na+ K+ ATPase som kan lokaliseres ved anvendelse av immunocytokjemi så vel som måles ved anvendelse av enzymatiske forsøk. Én metode for lokalisering av klorid-celler er å oppnå snitt av gjellene (f.eks. paraffin-snitt) og merke snittene med et anti-natrium kalium (Na+K+)ATPase antistoff (mus monoklonal alfa 5 anti-Na+K+ ATPase antistoff). Na+K+ ATPase-aktivitet er funnet i klorid-celler og kan anvendes som en markør for klorid-celler. Antistoffet kan være merket eller et andre antistoff som er merket og kan binde til anti-Na+K+ ATPase-antistoffet kan anvendes for å merke og observere klorid-cellene. Se Seidelin et al., Physiol Biochem Zool. 73(4):446-53 (2000).Distribusjonen av klorid-celler i de primære lameller (PL) og de sekundære lameller (SL) kan bestemmes ved anvendelse av et forhold. Et forhold av antallet klorid-celler i SL til antallet klorid-celler i PL (SL/PL) blir bestemt. I pre-voksne anadrome fisk som blir holdt i ferskvann og ikke underkastet metodene ifølge foreliggende oppfinnelse, er SL/PL-forholdet kjent på området og er generelt mellom ca. 0,6 og ca. 1,8. Fisk underkastet metodene ifølge foreliggende oppfinnelsen og fortsatt er i ferskvann viser i ett forsøk, en reduksjon i SL/PL-forhold. Et slikt forhold er generelt mellom ca. 0,1 og ca. 1,0, et forhold nærmere det sett for fisk som er overført til sjøvann (f.eks. forhold mellom ca. 0 og ca. 0,18). Se Eksempel 21. Således fører fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse til reduksjon av SL/PL-forhold i pre-voksne anadrome fisk som blir holdt i ferskvann ved å underkaste fisken metodene beskrevet her (f.eks. APS Prosess I eller II).Tilsvarende omfattes metoder for å øke Na+K+ ATPase-aktivitet i klorid-celler. Det er generelt kjent at spesifikk epitelceller betegnet klorid-celler til stede på gjelle-lameller i fisk er viktig for deres overlevelse i både ferskvann og sjøvann. I ferskvannstilpasset fisk pumper gjelle-klorid-celler Na+ og Cl-ioner som er til stede i fortynnede konsentrasjoner i det omgivende ferskvann inn i kroppsvæskene til fisken og setter fisken i stand til å opprettholde dens normale ioniske sammensetning i kroppen. I motsetning, når samme fisk blir overført til sjøvann, remodellerer gjelle-klorid-celler deres struktur og funksjon og tillater dem å fjerne overskudd av Na+ og Cl-akkumulert i kroppsvæsken til fisk som er et resultat av at de drikker hyperosmotisk sjøvann. Klorid-celler inneholder slikt rikelig Na+ K+ ATPase protein at både tilstedeværelsen og aktiviteten til dette enzym kan anvendes som en markør for identifikasjon av klorid-celler og en indikator for deres funksjon. Fisk underkastet fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse (f.eks. APS Prosess I eller II) viser en økning i ekspresjon og/eller aktivitet til Na+ K+ ATPase-protein. I ett eksempel ble betydelige økninger i Na+ K+ ATPase-aktivitet til klorid-celler funnet i gjellevev, sett i fisk underkastet APS Prosess II, sammenlignet med fisk som ble holdt i ferskvann og ikke underkastet APS Prosess II. Se Eksempel 21.Na+ K+ ATPase-aktivitet kan måles ved anvendelse av enzymatiske metoder, som er ytterligere beskrevet her. Homogenater av vev inneholdende klorid-celler (f.eks. gjelle eller pylorisk caeca) blir oppnådd og underkastet et enzymatisk forsøk hvor ATP-hydrolyse blir målt. Na+,K+-ATPase-aktivitet kan beregnes fra forskjellen i ATP-hydrolyse med eller uten ouabain og normalisert for protein-innhold i brønner. Dette protein kan analyseres i en plateleser ved anvendelse av for eksempel Coomassie basert Bio-Rad proteinforsøk (Bio- Rad, Hercules, CA). Eksempel 21 beskriver mer detaljert en protokoll for å måle Na+K+ATPase-aktivitet. Metoder for kvantifisering av Na+ K+ ATPase og/eller lokalisering av klorid-celler, som er kjent på området eller blir utviklet i fremtiden, kan anvendes. Se Seidelin et al., Physiol Biochem Zool. 73(4):446-53 (2000) og McCormick, Can. J. FishAquat. Sei. 50, 656-658 (1993).Det finnes metoder for detektering av nivået av PVCR for å bestemme hvorvidt fisk er klare for overføring fra ferskvann til sjøvann. Metoder som måler PVCR-nivåer omfatter mange egnede forsøk. Egnede forsøk omfatter immunologiske metoder, så som FACS-analyse, radioimmunoassay, strømningscytometri, immunocytokjemi, enzym-bundete immunosorbent-forsøk (ELISA) og kjemiluminescens-forsøk. Hvilken som helst metode kjent nå eller som utvikles senere kan anvendes for å måle PVCR-ekspresjon.Antistoffer reaktive med PVCR eller deler derav kan anvendes. I en foretrukket utførelsesform binder antistoffene spesifikt til PVCR eller en del derav. Antistoffene kan være polyklonale eller monoklonale og betegnelsen antistoff skal omfatte polyklonale og monoklonale antistoffer og funksjonelle fragmenter derav. Betegnelsene polyklonale og monoklonale refererer til graden av homogenitet av et antistoff-preparat og er ikke ment å være begrenset til spesielle produksjonsmetoder.I mange metoder detekterer immunologiske teknikker PVCR-nivåer ved hjelp av et anti-PVCR-antistoff (dvs. ett eller flere antistoffer). Betegnelsen "anti-PVCR" antistoff omfatter monoklonale og/eller polyklonale antistoffer og blandinger derav.Anti-PVCR-antistoffer kan fremkalles mot passende immunogener, så som isolert og/eller rekombinant PVCR eller del derav (omfattende syntetiske molekyler, så som syntetiske peptider). I en metode blir antistoffer fremkalt mot en isolert og/eller rekombinant PVCR eller del derav (f.eks. et peptid) eller mot en vertscelle som uttrykker rekombinant PVCR. I tillegg kan celler som uttrykker rekombinant PVCR, så som transfekterte celler, anvendes som immunogener eller i en screening for antistoff som binder reseptor.Hvilken som helst egnet teknikk kan preparere det immuniserende antigen og produsere polyklonale eller monoklonale antistoffer. Teknikken omfatter en rekke slike metoder (se f.eks. Kohler et al., Nature, 256: 495-497(1975) og Eur. J. Immunol. 6: 511-519 (1976); Milstein et al., Nature 266: 550-552 (1977); Koprowski et al., U.S. Patent nr. 4,172,124; Harlow, E. og D. Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY); Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2 (Supplement 27, Sommer '94), Ausubel, F.M. et al., Eds., (John Wiley & Sons: New York, NY), kapittel 11,(1991)). Generelt kan kondensering av en egnet udødelig eller myelom-cellelinje, så som SP2/0, med antistoff-produserende celler produsere et hybridom. Dyr immunisert med antigenet av interesse gir antistoff-produserende celle, fortrinnsvis celler fra milt eller lymfeknuter. Selektive kulturbetingelser isolerer antistoff-produserende hybridomceller mens begrensende fortynningsteknikker produsere dem. Forskere kan anvende egnede forsøk så som ELISA for å selektere antistoff-produserende celler med den ønskede spesifisitet.Andre egnede metoder kan produsere eller isolere antistoffer med den ønskede spesifisitet. Eksempler på andre metoder omfatter seleksjon av rekombinant antistoff fra et bibliotek eller basering på immunisering av transgene dyr så som mus.I henhold til metoden kan et forsøk bestemme nivået av PVCR i en biologisk prøve. For bestemmelse av mengdene av PVCR, omfatter et forsøk kombinering av prøven som skal testes med et antistoff som har spesifisitet for PVCR, under betingelser egnet for dannelse av et kompleks mellom antistoff og PVCR og detektering eller måling (direkte eller indirekte) av dannelsen av et kompleks. Prøven kan oppnås direkte eller indirekte og kan fremstilles ved en metode egnet for den spesielle prøve og forsøksformat valgt.Spesielt kan vevprøver, f.eks. gjellevev-prøver, tas fra fisk etter at de er bedøvet med MS-222. Vevprøvene blir fiksert ved nedsenking i 2% paraformaldehyd i passende Ringers løsning svarende til osmolaliteten av fisken, vasket i Ringers, deretter frosset i en innstøpende forbindelse, f. eks. O.C.T.™ (Miles, Inc., Elkahart, Indiana, USA) ved anvendelse av metylbutan avkjølt med flytende nitrogen. Etter kutting av 8-1 Ou. vev-snitt med rn kryostat, blir individuelle snitt underkastet forskjellige merkingsprotokoller. For eksempel blir snittet: 1) blokkert med geit serum eller serum oppnådd fra samme arter av fisk, 2) inkubert med kanin anti-CaR eller anti-PVCR antiserum og 3) vasket og inkubert med peroksydase-konjugert affinitetsrenset geit antikanin antiserum. Lokasjonene av bundet peroksydase-konjugert geit antikanin antiserum blir deretter visualisert ved utvikling av et rose-farget aminoetylkarbazol-reaksjonsprodukt. Individuelle snitt blir montert, betraktet og fotografert ved standard lysmikroskopi-teknikker. Anti-CaR antiserum anvendt for å detektere fisk PVCR-protein blir fremkalt i kaniner ved anvendelse av et 23-mer peptid svarende til aminosyrer nummer 214-236 lokalisert i det ekstracellulære domenet av RaKCaR-protein. Sekvensen av 23-mer peptidet er: ADDDYGRPGIEKFREEAEERDIC (SEKV ID NR.: 19) et lite peptid med sekvensen DDYGRPGIEKFREEAEERDICI (SEKV ID NR.: 20) eller ARSRNSADGRSGDDLPC (SEKV ID NR.: 21) kan også anvendes for å fremstille antisera inneholdende antistoffer mot PVCR. Slike antistoffer kan være monoklonale, polyklonale eller kimære.Egnede merker kan detekteres direkte, så som radioaktive, fluorescerende eller kjemiluminescente merker. De kan også detekteres indirekte ved anvendelse av merker så som enzym-merker og andre antigene eller spesifikke bindingspartnere så som biotin. Eksempler på slike merker omfatter fluorescerende merker så som fluorescein, rhodamin, kjemiluminescente merker så som luciferase, radioisotop-merker så som 32P, 125l, 131l, enzym-merker så som pepperrot peroksydase og alkalisk fosfatase, (3-galaktosidase, biotin, avidin, spinn-merker og lignende. Deteksjon av antistoffer i et kompleks kan også utføres immunologisk med et andre antistoff som deretter blir detektert (f.eks. ved hjelp av et merke). Konvensjonelle metoder eller andre egnede metoder kan direkte eller indirekte merke et antistoff.Ved utførelse av metoden forandrer nivåene av PVCR i forskjellige vev seg sammenlignet med kontroll. Modulerte nivåer eller tilstedeværelsen av PVCR-ekspresjon i forskjellige vev, sammenlignet med en kontroll, indikerer at fisken eller populasjonen av fisk fra hvilken en statistisk signifikant mengde av fisk ble testet, er klare for overføring til ferskvann. En kontroll angir et nivå av PVCR, hvis noe, fra en fisk som ikke er underkastet trinnene ifølge foreliggende oppfinnelse, f.eks. ikke utsatt for ferskvann som har en PVCR-modulator og/eller ikke matet en NaCI-diett. For eksempel viser Figurer 13 og 18 at fisk ikke underkastet foreliggende oppfinnelse hadde intet detekterbart PVCR-nivå, mens fisk som var underkastet trinnene ifølge foreliggende oppfinnelse hadde PVCR-nivåer som lett ble detektert.PVCR kan også undersøkes ved Northern blot analyse av mRNA fra vev-prøver. Northern blot analyse fra forskjellige haivev har vist at den høyeste grad av PVCR-ekspresjon er i gjellevev, fulgt av nyren og den rektal kjertel. Det synes å være minst tre distinkte mRNA-arter på ca. 7 kb, 4,2 kb og 2,6 kb.PVCR kan også undersøkes ved hybridisering, f.eks. ved hybridisering av én av PVCR-sekvensene gitt her (f.eks. SEKV ID NR: 1,3,5,7,9,11,13,15) eller et oligonukleotid avledet fra én av sekvensene, til en DNA-inneholdende vevsprøve fra en fisk. En slik hybridiseringssekvens kan ha et detekterbart merke, f.eks. radioaktivt, fluorescerende, etc, bundet for å tillate deteksjon av hybridiseringsprodukt. Metoder for hybridisering er velkjente og slike metoder er gitt i U.S. Pat. nr. 5,837,490, av Jacobs et al., idet hele innholdet av dette inntas her ved referanse i sin helhet. Utformingen av oligonukleotid-proben bør fortrinnsvis følge disse parametere: (a) den bør være utformet til et område av sekvensen som har færrest ubestemmelige baser ("N's"), hvis noen og (b) den bør være utformet for å ha en Tm på ca. 80°C (assuming 2°C for hver A eller T og 4 grader for hver G eller C).Stringens-betingelser for hybridisering angir temperaturbetingelser og buffersammensetning som tillater hybridisering av en første nukleinsyresekvens til en andre nukleinsyresekvens, hvor betingelsene bestemmer graden av identitet mellom de sekvenser som hybridiserer til hverandre. Derfor er "høy-stringens-betingelser" de betingelser hvor bare nukleinsyresekvenser som er meget lignende hverandre vil hybridisere. Sekvensene kan være mindre lignende hverandre hvis de hybridiserer under moderate stringens-betingelser. Enda mindre similaritet er nødvendig for to sekvenser å hybridisere under lave stringens-betingelser. Ved å variere hybridiseringsbetingelsene fra et stringensnivå ved hvilket ingen hybridisering skjer, til et nivå ved hvilket hybridisering først er observert, kan betingelsene bestemmes ved hvilke en gitt sekvens vil hybridisere til de sekvenser som er mest lignende den. Den nøyaktige betingelsesbestemmelse av stringensen for en spesiell hybridisering omfatter ikke bare ionestyrke, temperatur og konsentrasjon av destabiliserende midler så som formamid, men også faktorer så som lengden av nukleinsyresekvensene, deres base-sammensetning, prosenten av mismatchede basepar mellom de to sekvenser og hyppigheten av forekomst av subsett av sekvensene (f.eks. små strekk med repetisjoner) innen andre ikke-identiske sekvenser. Vasking er trinnet hvor betingelsene blir satt for å bestemme et minimumsnivå av similaritet mellom sekvensene som hybridiserer med hverandre. Generelt, fra den laveste temperatur ved hvilken bare homolog hybridisering forekommer, resulterer en 1% mismatch mellom to sekvenser i en 1 °C reduksjon i smeltetemperaturen (Tm) for hvilken som helst valgt SSC-konsentrasjon. Generelt resulterer en dobling av konsentrasjonen av SSC i en økning i Tm på ca. 17°C. Ved anvendelse av disse retningslinjer kan vasketemperaturen bestemmes empirisk, avhengig av nivået av mismatch søkt. Hybridiserings- og vaskebetingelser er forklart i Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al., ed., John Wiley & Sons, Inc., 1995, med supplerende oppdateringer) på sider 2,10,1 til 2,10,16 og 6,3,1 til 6,3,6.Høy-stringens-betingelser kan anvende hybridisering ved enten (1) 1x SSC (10x SSC = 3 M NaCI, 0,3 M Na3-citrat.2H20 (88 g/liter), pH til 7,0 med 1 M HCI), 1% SDS (natrium dodecylsulfat), 0,1 - 2 mg/ml denaturert kalvethymus-DNA ved 65°C, (2) 1x SSC, 50% formamid, 1% SDS, 0,1-2 mg/ml denaturert kalvethymus-DNA ved 42°C, (3) 1% bovint serumalbumin (fraksjon V), 1 mM Na2.EDTA, 0,5 M NaHP04 (pH 7,2) (1 M NaHP04 = 134 g Na2HP04.7H20, 4 ml 85% H3P04 pr. liter), 7% SDS, 0,1-2 mg/ml denaturert kalvethymus DNA ved 65°C, (4) 50% formamid, 5x SSC, 0,02 M Tris-HCI (pH 7,6), 1x Denhardfs løsning (100x = 10 g Ficoll 400,10 g polyvinylpyrrolidon, 10 g bovint serumalbumin (fraksjon V), vann til 500 ml), 10% dekstransulfat, 1% SDS, 0,1-2 mg/ml denaturert kalvethymus DNA ved 42°C, (5) 5x SSC, 5x Denhardfs løsning, 1% SDS, 100 u.g/ml denaturert kalvethymus DNA ved 65°C eller (6) 5x SSC, 5x Denhardfs løsning, 50% formamid, 1% SDS, 100 u.g/ml denaturert kalvethymus DNA ved 42°C, med høy-stringens vaskinger med enten (1) 0,3 - 0,1x SSC, 0,1% SDS ved 65°C eller (2) 1 mM Na2EDTA, 40 mM NaHP04 (pH 7,2), 1% SDS ved 65°C. Betingelsene ovenfor skal anvendes for DNA-DNA-hybrider på 50 basepar eller lenger. Når hybridet er antatt å være mindre enn 18 basepar i lengde, bør hybridiserings- og vaske-temperaturer være 5 - 10°C under den beregnede Tm for hybridet, hvor Tm i °C = (2 x antallet A- og T-baser) + (4 x antallet G- og C-baser). For hybrider antatt å være ca. 18 til ca. 49 basepar i lengde, er Tm i °C = (81,5°C + 16,6(logi0M) + 0,41 (% G + C) - 0,61 (% formamid) - 500/L), hvor "M" er molariteten av monovalente kationer (f.eks. Na+) og "L" er lengden av hybridet i basepar.Moderate stringens-betingelser kan anvende hybridisering ved enten (1) 4x SSC, (10x SSC = 3 M NaCI, 0,3 M Na3-citrat.2H20 (88 g/liter), pH til 7,0 med 1 M HCI), 1% SDS (natrium-dodecylsulfat), 0,1 - 2 mg/ml denaturert kalvethymus DNA ved 65°C, (2) 4x SSC, 50% formamid, 1% SDS, 0,1-2 mg/ml denaturert kalvethymus DNA ved 42°C, (3) 1% bovint serumalbumin (fraksjon V), 1 mM Na2.EDTA, 0,5 M NaHP04 (pH 7,2) (1 M NaHP04 = 134 g Na2HP04.7H20, 4 ml 85% H3P04 pr. liter), 7% SDS, 0,1-2 mg/ml denaturert kalvethymus DNA ved 65°C, (4) 50% formamid, 5x SSC, 0,02 M Tris-HCI (pH 7,6), 1x Denhardfs løsning (100x = 10 g Ficoll 400,10 g polyvinylpyrrolidon, 10 g bovint serumalbumin (fraksjon V), vann til 500 ml), 10% dekstransulfat, 1% SDS, 0,1 - 2 mg/ml denaturert kalvethymus DNA ved 42°C, (5) 5x SSC, 5x Denhardfs løsning, 1% SDS, 100 ug/ml denaturert kalvethymus DNA ved 65°C eller (6) 5x SSC, 5x Denhardfs løsning, 50% formamid, 1% SDS, 100 (xg/ml denaturert kalvethymus DNA ved 42°C, med moderat stringens vaskinger med 1x SSC, 0,1% SDS ved 65°C. Betingelsene ovenfor skal anvendes for DNA-DNA-hybrider med 50 basepar eller lenger. Når hybridet er antatt å være mindre enn 18 basepar i lengde, bør hybridiserings- og vasketemperaturer være 5 - 10°C under den den beregnede Tm for hybridet, hvor Tm i °C = (2 x antallet A- og T-baser) + (4 x antallet G- og C-baser). For hybrider antatt å være ca. 18 til ca. 49 basepar i lengde, er Tm i °C = (81,5°C + 16,6(log10M) + 0,41 (% G + C) - 0,61 (% formamid) - 500/L), hvor "M" er molariteten av monovalente kationer (f.eks. Na+) og "L" er lengden av hybridet i basepar.Lavstringens-betingelser kan anvende hybridisering ved enten (1) 4x SSC, (10x SSC = 3 M NaCI, 0,3 M Na3-citrat.2H20 (88 g/liter), pH til 7,0 med 1 M HCI), 1% SDS (natrium-dodecylsulfat), 0,1 - 2 mg/ml denaturert kalvethymus DNA ved 50°C, (2) 6x SSC, 50% formamid, 1% SDS, 0,1 - 2 mg/ml denaturert kalvethymus DNA ved 40°C, (3) 1% bovint serumalbumin (fraksjon V), 1 mM Na2.EDTA, 0,5 M NaHP04 (pH 7,2) (1 M NaHP04 = 134 g Na2HP04.7H20, 4 ml 85% H3P04 pr. liter), 7% SDS, 0,1 - 2 mg/ml denaturert kalvethymus DNA ved 50°C, (4) 50% formamid, 5x SSC, 0,02 M Tris-HCI (pH 7,6), 1x Denhardfs løsning (100x = 10 g Ficoll 400, 10 g polyvinylpyrrolidon, 10 g bovint serumalbumin (fraksjon V), vann til 500 ml), 10% dekstransulfat, 1% SDS, 0,1 - 2 mg/ml denaturert kalvethymus DNA ved 40°C, (5) 5x SSC, 5x Denhardfs løsning, 1% SDS, 100 u.g/ml denaturert kalvethymus DNA ved 50°C eller (6) 5x SSC, 5x Denhardfs løsning, 50% formamid, 1% SDS, 100 |xg/ml denaturert kalvethymus DNA ved 40°C, med lav-stringens vaskinger med enten 2x SSC, 0,1% SDS ved 50°C eller (2) 0,5% bovint serumalbumin (fraksjon V), 1 mM Na2EDTA, 40 mM NaHP04 (pH 7,2), 5% SDS. Betingelsene ovenfor skal anvendes for DNA-DNA-hybrider på 50 basepar eller lenger. Når hybridet er antatt å være mindre enn 18 basepar i lengde, bør hybridiserings- og vaske-temperaturer være 5 - 10°C under den beregnede Tm av hybridet, hvor Tm i °C = (2 x antallet A- og T-baser) + (4 x antallet G- og C-baser). For hybrider antatt å være ca. 18 til ca. 49 basepar i lengde, er Tm i °C = (81,5°C + 16,6(logi0M) + 0,41 (% G + C) - 0,61 (% formamid) - 500/L), hvor "M" er molariteten av monovalente kationer (f.eks. Na+) og "L" er lengden av hybridet i basepar.Det finnes metoder for deteksjon av PVCR ved PCR-metoder ved anvendelse av primere beskrevet eller avledet fra sekvenser beskrevet her. For eksempel kan PVCR detekteres ved PCR ved anvendelse av SEKV. ID NR: 22 og 23, som beskrevet i Eksempel 9. PCR er selektiv amplifisering av en målsekvens ved gjentatte runder av nukleinsyre-replikasjon ved anvendelse av sekvens-spesifikke primere og en termostabil polymerase. PCR tillater gjenvinning av hele sekvenser mellom to ender av en kjent sekvens. Metoder for PCR er beskrevet her og er kjent på området.Spesielt kan nivået av akvatisk PVCR bestemmes i forskjellige vev ved revers transkriptase-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) etter isolering av poly A+ RNA fra akvatiske arter. Metoder for PCR og RT-PCR er godt karakterisert på området (Se generelt, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (ed. H.A. Erlich, Freeman Press, NY, NY, 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Eds. Innis, et al., Academic Press, San Diego, CA, 1990); Mattila et al., Nucleic Acids Res., 19:4967(1991); Eckertet al., PCR Methods and Applications, 1:17(1991); PCR (ed. McPherson et al., IRL Press, Oxford); Ausebel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. og Wiley-Interscience 1987, & Supp. 49, 2000; og U.S. Patent 4,683,202). Kort angitt blir mRNA ekstrahert fra vevet av interesse og revers transkribert. Deretter blir en PCR-reaksjon utført med PVCR-spesifikke primere og tilstedeværelse av det antatte PVCR-produkt blir bestemt, for eksempel ved agarosegelelektroforese. Eksempler på PVCR-spesifikke primere er SEKV. ID NR.: 22 og/eller SEKV ID NR.: 23. Produktet av RT-PCR-reaksjonen som blir utført med PVCR-spesifikke primere er referert til her som et RT-PCR-produkt. RT-PCR-produktet kan omfatte nukleinsyremolekyler som har en del eller hele PVCR-sekvensen. RT-PCR- produktet kan eventuelt være radioaktivt merket og tilstedeværelse eller mengde av PVCR-produkt kan bestemmes ved anvendelse av autoradiografi. To eksempler på kommersielt tilgjengelige fluorescerende prober som kan anvendes i et slikt forsøk er Molecular Beacons (Stratagene) og Taqman® (Applied Biosystems). Alternative metoder for merking og kvantifisering av RT-PCR-produktet er velkjent for en fagmann på området (se Ausebel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. og Wiley-lnterscience 1987, & Supp. 49,2000. Poly A+ RNA kan isoleres fra hvilket som helst vev som inneholder minst én PVCR ved standard metoder. Slike vev omfatter for eksempel gjeller, nasale lameller, urinblære, nyre, tarm, mage, lever og hjerne.Endringer i ekspresjon eller sensitivitet av PVCR kan også utføres ved innføring av et egnet transgen. Egnede transgener ville omfatter enten PVCR-genet selv eller modifiseringsgener som direkte eller indirekte ville innvirke på PVCR-genekspresjon. Metoder for vellykket innføring, seleksjon og ekspresjon av transgenet i fiske-oocytter, embryoer og voksne er beskrevet i Chen, TT et al., Transgenic Fish, Trends in Biotechnology 8:209-215 (1990).Foreliggende oppfinnelse er videre og mer spesifikt illustrert ved de følgende Eksempler.Eksempel 1. Polyvalent cation-sensing receptors (PVCR) tjene som saltholdighetssensorer i fisk.Polyvalent cation-sensing receptors (PVCR) tjener som saltinnholdssensorer i fisk. Disse reseptorer er lokalisert til de apikale membraner av forskjellige celler innen fisken's kropp (f.eks. i gjeller, tarm, nyre) som er kjent å være ansvarlige for osmoregulering. En full-lengde kation-reseptor (CaR også referert til som "PVCR") fra småhai blir uttrykt i humane HEK-celler. Denne reseptor ble vist til respondere på endringer i ionisk sammensetning av NaCI, Ca2+ og Mg2+ i ekstracellulær væske som bader HEK-celler. De ioniske konsentrasjoner respondert på omfattet området som omfatter overgang fra ferskvann til sjøvann. Ekspresjon av PVCR mRNA er også øket i fisk etter deres overføring fra ferskvann til sjøvann og blir modulert av PVCR-agonister. Partielle genomiske kloner av PVCR har også vært isolert fra andre fiskearter, omfattende vinter- og sommer-flyndre og rognkjeks, ved anvendelse av nukleinsyre-amplifisering med degenererteDenne metoden ble også anvendt for å isolere partielle genomiske kloner av PVCR for atlantisk laks (Fig. 1), arktisk røye (Fig. 2) og regnbueørret(Fig. 3). De degenererte oligonukleotid-primere anvendt var 5'-TGT CKTGGA CGG AGC CCT TYG GRA TCG C-3' (SEKV ID NR:22) OG 5'-GGC KGGRAT GAA RGA KAT CCA RAC RAT GAA G-3' (SEKV ID NR:23), hvor K er T eller G, Y er C eller T og R er A eller G. De degenererte oligoer ble dannet ved standard metoder (Preston, G.M., 1993, "Polymerase chain reaction with degenerate oligonucleotide primers to done gene family members," i: Methods in Mol. Biol., vol. 58, ed. A. Harwood, Humana Press, s. 303-312). Genomiske bånd fra disse tre arter ble amplifisert, renset ved agarose-gelelektroforese, ligert inn i en passende plasmidvektor (laks og arktisk røye arter-pT7 Blue (Novagen, Madison, Wl; ørret-anvendt pGem-T (Promega Biotech. Madison, Wl) og transformert til en passende bakteriell vertsstamme laks og arktisk røye - pT7 vektor med NovaBlue (Novagen, Madison, Wl) og ørret pGEM-T anvendt JM-109 E. coli celle som deretter ble dyrket i væske-medium. Plasmidene og insersjonene ble renset fra vertscellene og sekvensert. Fig. 4 viser de utledede aminosyresekvenser og oppstilling for PVCR fra atlantisk laks, arktisk røye og regnbueørret, i forhold tii PVCR fra nyren av småhai ( Squalus acantias).Eksempel 2: Overlevelse og vekst av pre-voksne anadrome fisk ved anvendelse av fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelseEt viktig trekk ved aktuell lakseoppdrett er plassering av smolt fra ferskvannsklekkerier til havmerder. Aktuelle metoder anvender smolt som har oppnådd en kritisk størrelse på omtrent 70-110 gram kroppsvekt. Foreliggende oppfinnelse kan enten anvendes både for å forbedre havmerd-overføring av standard 70-110 gram smolt så vel som for å tillate vellykket havmerd-overføring av mindre smolt som veier for eksempel bare 15 gram. For standard 70-110 gram smolt eliminerer anvendelse av foreliggende oppfinnelse fenomenet kjent som "smolt-vindu" og tillater at fisken blir holdt og overført til sjøvann ved 15°C eller høyere. Anvendelse av foreliggende oppfinnelse for 15 gram eller større smolt tillater større utnyttelse av ferskvannsklekkeri-kapasiteter fulgt av vellykket sjøvann overføring til havmerder. I begge tilfeller spiser fisk som gjennomgåt trinnene ifølge foreliggende oppfinnelse mye innen et kort tidsintervall etter overføring til havmerder og viser således rask vekstgrad etter overføring til sjøvann.Figur 5 viser i skjematisk form nøkkeltrekk ved aktuell akvakultur av atlantisk laks ved havtemperaturer til stede i Europa og Chile. Egg blir klekket i innlands ferskvannsklekkerier og den resulterende yngel vokser til fingerling og parr. Raskere voksende parr kan gjennomgå smoltifisering og plassering i havmerder som SO smolt (70 gram) i løpet av år 01. I motsetning blir langsommere voksende parr smoltifisert i år 02 og plassert i nerder som S1 smolt (100 gram). Ved både SO- og S1-overføring til sjøvann er tilstedeværelse av kjøligere hav- og ferskvanns-temperaturer ønsket for å minimalisere stresset ved osmotisk sjokk for nyoverført smolt. Dette gjelder spesielt for S1-smolt siden ferskvannsklekkerier ofte er lokalisert i en betydelig distanse fra havmerd- voksesteder og deres vanntemperaturer stiger raskt i løpet av tidlig sommer. Således gir kombinasjonen av stigende vanntemperaturer og tendensen til smolt til å revertere eller dø når holdt i forlengede intervaller i ferskvann et behov for overføring av smolt til sjøvann under smolt-"vinduet".Standard smolt som nylig er plassert i havmerder er ikke i stand til å vokse optimalt i løpet av deres først 40-60 dagers periode i sjøvann på grunn av tilstedeværelse av osmotisk stress som forsinker deres foring. Dette intervall med osmotisk tilpasning forhindrer smolten fra å dra fordel av et stort antall graddager umiddelbart etter enten vår- eller høst-plassering. Kombinasjonen av tilstedeværelse av smolt-"vindu" sammen med forsinkelse i oppnåelse av optimal smolt-vekst forlenger oppvekstintervallet for å oppnå fisk med markedsstørrelse. Dette er spesielt problematisk for SO siden timing for deres slakting noen ganger blir komplisert av forekomst av "grilsing" i utviklet fisk som blir eksponert for reduksjoner i omgivelses-fotoperiode.De følgende eksempler refererer til APS Prosess I og APS Prosess II gjennom det hele. APS står for "AquaBio Products Sciences®, L.L.C." APS Prosess I er også referert til her som "SUPERSMOLT ™ I Prosess" eller "Prosess I." En "APS Prosess I" fisk eller smolt angir en fisk eller smolt som har gjennomgått trinnene i APS Prosess I. En APS Prosess I smolt er også referert til som "SUPERSMOLT ™ I" eller en "Prosess I" smolt. Likeledes er APS Prosess II også referert til her som "SUPERSMOLT ™ II Prosess" eller "Prosess II." En "APS Prosess II" fisk eller smolt angir en fisk eller smolt som har gjennomgått trinnene i APS Prosess II. En APS Prosess II smolt er også referert til som "SUPERSMOLT ™ II" eller "Prosess II" smolt.APS Prosess I: Pre-voksne anadrome fisk (dette omfatter både kommersielt produsert SO-, S1- eller S2-smolt så vel som mindre parr/smolt fisk) blir eksponert for eller holdt i ferskvann inneholdende enten 2,0-10,0 mM kalsium- og 0,5-10,0 mM magnesium-ioner. Dette vannet blir fremstilt ved tilsetning av kalsiumkarbonat og/eller -klorid og magnesiumklorid til ferskvannet. Fisken blir matet med forpellet inneholdende 7% (vekt/vekt) NaCI. Se Eksempel 8 for ytterligere detaljer angående foret. Fisk blir eksponert for eller holdt i dette regimet av vannblanding og for totalt 30-45 dager, ved anvendelse av standard klekkeri-forvarings-teknikker. Vanntemperaturer varierer mellom 10-16°C. Fisk blir eksponert for en konstant fotoperiode for varigheten av APS Prosess I. Et fluorescerende lys blir anvendt for fotoperioden.APS Prosess II: Pre-voksne anadrome fisk (dette omfatter både kommersielt produsert SO-, S1- eller S2-molt så vel som mindre parr/smolt fisk) blir eksponert for eller holdt i ferskvann inneholdende 2,0-10,0 mM kalsium- og 0,5-10,0 mM magnesium-ioner. Dette vannet blir fremstilt ved tilsetning av kalsiumkarbonat og/eller -klorid og magnesiumklorid til ferskvannet. Fisk blir matet med forpellet inneholdende 7% (vekt/vekt) NaCI og enten 2 g eller 4 g av L-tryptofan pr. kg for. Se Eksempel 8 for ytterligere detaljer angående foret. Fisk blir eksponert for eller holdt i dette regimet av vannblanding og for totalt 30-45 dager ved anvendelse av standard klekkeri-forvaringsteknikker. Vann-temperaturer varierer mellom 10-16°C. Fisk blir eksponert for en konstant fotoperiode for varigheten av APS Prosess II. Et fluorescerende lys blir anvendt for fotoperioden.SEKSJONI: Demonstrasjon av fordelene av APS Prosess I For atlantisk laks, ørret og arktisk røye.APS Prosess I øker overlevelsen av små atlantisk laks S2 lignende smolt etter deres overføring til sjøvann sammenlignet med matchede ferskvanns-kontroller. Optimal overlevelse blir oppnådd ved anvendelse av den fullstendige prosess bestående av både magnesium- og kalsium-vannblandingen så vel som NaCI-diett. I motsetning produserte administrering av kalsium og magnesium enten vare via foret eller uten NaCI-kosttilskudd ikke resultater ekvivalente med APS Prosess I.Tabell 1 viser data oppnådd fra atlantiske laks S2 lignende smolt mindre enn 1 år gamle som veier omtrent 25 g. Denne enkle gruppe med fisk ble fordelt i 4 spesifikke grupper som angitt nedenfor og hver ble holdt under identiske laboratoriebetingelser bortsett fra variablene testet. Alle fisk ble holdt ved en vanntemperatur på 9-13°C og en kontinuerlig fotoperiod for varigheten av forsøket. Kontroll-ferskvannsgruppen som var igjen i ferskvann i den innledende 45 dagers periode opplevde en 33% dødelighetsgrad under disse betingelsene slik at bare 67% kunne overføres til sjøvann. Etter overføring til sjøvann opplevet denne gruppen også høy dødelighet hvor bare halvparten av disse smolt overlevde. Inklusjon av kalsium (10 mM) og magnesium (5 mM) i foret gitt til smolt (Ca2+/Mg2+diett) reduserte overlevelse sammenlignet med kontroller både i ferskvann (51% vs 67%) så vel som etter sjøvanns-overføring (1% vs 50%). I motsetning forbedret inklusjon av 10 mM Ca2+ og 5 mM Mg2+ i ferskvannet (APS Prosess I bare vann) smolt-overlevelse i APS Prosess I vann så vel som etter overføring av smolt til sjøvann. Imidlertid ble optimale resultater oppnådd (99% overlevelse i både APS Prosess I vannblanding så vel som etter sjøvanns-overføring) når smolt ble holdt i APS Prosess I vannblanding og matet med en diett supplert med 7% natriumklorid.Anvendelse av APS Prosess I for plassering av 70-100 g smolt i sjøvann.Disse data viser at anvendelse av APS Prosess I eliminerer "smolt-vindu" og tilveiebringer umiddelbar smolt-foring og betydelig forbedring i smolt-vekstheastigheter.Smolt avledet fra St. John stammen av atlantisk laks produsert av Connors Brothers Deblois Hatchery lokalisert i Cherryfield, Maine, USA ble anvendt for denne storskala-test. Smolt ble produsert ved anvendelse av standard praksis ved dette klekkeri og ble tatt fra en januar 1999 egg-klekking. Alle smolt ble overført ved standard kommersielt tilgjengelige smolt-transportbiler og overføringspersonale. S1 smolt ble anskaffet under Maine's år 2000 smolt-vindu og smolt-leveringer ble tatt mellom datoene 29. april 2000 -15. mai 2000. Smolt ble enten overført direkte til polarsirkel merder (24 m diameter) lokalisert i Blue Hill Bay Maine (kontroller) eller levert til behandlingsanlegg hvor de ble behandlet med APS Prosess I i totalt 45 dager. Etter å ha fått APS Prosess l-behandling, ble smolten deretter transportert til identisk Blue Hill Bay merd-ste og plassert i et tilstøtende rektangulært stålbur (15mX15mX5m) for oppvoksing. Begge grupper fisk mottok en identisk blanding av fuktig (38% fuktighet) og tørt (10% fuktighet) laksefor (Connors Bros). Hver av merdene ble matet ved hånd eller forblåser til metning to ganger pr. dag ved anvendelse av kamera-visualisering av foring. Mort-dykk ble utført på en regulær basis og hver merd fikk identisk standard forvaringspraksis etablert på denne laksetarm. Prøver av fisk for vekstanalyser ble tatt etter enten 42 dager (APS Prosess I) eller 120 dager eller mer (kontroll). I begge tilfeller ble fisk fjernet fra merdene og multiple analyser utført som beskrevet nedenfor.Alle beregninger for å oppnå for-omdannelsesforhold (FCR) eller spesifikk vekstgrad (SGR) og vekstfaktor (GF3) ble utført ved anvendelse av standard aksepterte formler (Willoughby, S. Manual of Salmonid Farming Blackwell Scientific, Oxford UK 1999) og etablert r målinger av graddager for Blue Hill Bay stedet som gitt i Tabell 2 nedenfor. En graddag blir beregnet ved å multiplisere antallet dager i en måned med gjennomsnittlig daglig temperatur i grader Celsius.Tabell 3 viser data oppnådd etter sjøvanns-overføring av kontroll S1 smolt. Smolt i området 75-125 g ble plassert i 3 uavhengige merder og underkastet normal oppdrettspraksis demonstrerte karakteristika typiske for dagens lakse-akvakultur i Maine. Betydelig dødelighet (gjennomsnittlig 3,3%) ble erfart etter overføring til avkjølt (10°C) sjøvann og full foring ble oppnådd bare etter et betydelig intervall (-56 dager) i havmerder. Som et resultat var gjennomsnittlige SGR- og GF3-verdier for disse 3 merder henholdsvis 1,09 og 1,76 for 105-121 dagers-perioden målt.I motsetning til den umiddelbare overføring av Kontroll S1-smolt som beskrevet ovenfor til havmerder (Tabell III) ble totalt 10.600 S1 smolt som har en gjennomsnittlig størrelse på 63,6 gram transportert on 11. mai 2000 fra Deblois ferskvanns-klekkeri til forskningsanlegget. Mens de ble holdt i standard sirkulære tanker, ble disse fisk holdt totalt 45 dager ved en gjennomsnittlig vanntemperatur på 11°C og ble underkastet APS Prosess I. Under denne perioden var smolt-dødelighet bare 64 fisk (0,6%). Som en matchet kontroll for APS Prosess I fisk, ble en mindre gruppe med kontrollfisk (n=220) holdt under identiske betingelser, men fikk ikke APS Prosess I behandling. Dødeligheten av disse kontrollfisk ble minimalisert ved å holde temperaturen på 10°C og var ekvivalent med behandlede smolt før overføring til sjøvann.I løpet av den 45 dagers perioden når S1 smolt mottok APS Prosess I, vokste fisken gjennomsnittlig 10 gram og hadde således en gjennomsnittsvekt på 76,6 g når overført til en havmerden. Den virkelige smoltoverføring til sjøvann som skjedde 26. juni 2000 var bemerkelsesverdig for den uvanlige vigør av smolten som normalt ville vært problematisk siden dette tidspunkt er godt forbi det normael for sjøplassering av smolt. Sjøtemperaturen på tidspunktet for APS Prosess I smolt merdplassering var 15,1°C. I motsetning til motstykket S1-smolt underkastet standard industripraksis beskrevet ovenfor, spiste APS Prosess I smolt godt innen 48 timer av sjøplassering og fortsatte å øke deres konsum av mat under den umiddelbare post-overføringsperioden. Dødeligheten av APS Prosess I smolt var sammenlignbar med den til smolt plassert tidligere på sommeren (6,1%) under de innledende 50 dager etter havmerd-plassering og to tredjedeler av de mortalitetene kunne direkte tilskrives skala-tap og annen fysisk skade pådratt under overføringsprosessen selv.I motsetning klarte tilsvarende kontrollfisk (holdt under identiske betingelser uten APS Prosess l-behandling) seg ikke bra under overføring til merden (17% overføringsdødelighet) og spiste ikke for bra på noe tidspunkt i løpet av de første 20 dager etter havmerd-plasseringen. Dette mindre antall av kontroll-fisk (176) ble holdt i en mindre (1,5mX1,5mX1,5m) mer som fløt innenfor den større merd inneholdende APS Prosess I smolt. Deres dødelighet etter havmerd-plassering var meget høy med 63% innen 51 dagers intervall.Både APS Prosess I og kontrollsmolt ble matet på en daglig basis på en måte identisk med den opplevet av industristandard-fisk vist i Tabell 3. APS Prosess I fisk ble undersøkt 51 dager etter deres sjøvannsplassering og sammenlignet med Industristandard-smolt vist i Tabell 3. Som vist i Tabell 4 avslører sammenligning av deres karakteristika dramatiske forskjeller mellom industristandard-smolt vs APS Prosess I.I oppsummering omfatter bemerkelsesverdige forskjeller mellom APS Prosess I, kontroll-smolt og Industristandard-smolt:1. Dødeligheten observert etter havmerd-plassering var lav for APS Prosess I (6,1%) vs kontroll (63%) til tross for det faktum at disse fisk ble overført til sjøvann 1,5 måneder etter smolt-vinduet og med en meget høy (15,1°C) sjøvann-temperatur. Dødeligheten av APS Prosess I var sammenlignbar med den til akseptert industristandard smolt (3-10%) overført til kjøligere (10°C) sjøvann under smolt-rammen. Dette karakteristiske trekk ved APS Prosess I tilveiebringer en større fleksibilitet i ferskvanns-klekkeri-operasjoner siden plassering av APS Prosess I smolt ikke er strengt begrenset til det konvensjonelle "smolt-vindu" for tiden anvendt i industripraksis. 2. APS Prosess I fisk var i toppkondisjon under og umiddelbart etter sjøvannsoverføring. I motsetning til industristandard smolt som trengte 56 dager for å nå full foring, spiste APS Prosess I smolt bra innen 2 dager. Videre er den innledende veksthastighet (SGR 1,8) demonstrert av APS Prosess I smolt betydelig større enn publiserte data for standardsmolt under deres innledende 50 dager etter sjøvann-plassering (publiserte verdier (Stradmeyer, L. Is feeding nonstarters a waste of time. Fish Farmer 3:12-13, 1991; Usher, ML, C Talbot og FB Eddy. Effects of transfer to seawater on growth and feeding in Atlantic salmon smolts (Salmo salar L.) Aquaculture 94:309-326,1991) for SGR område mellom 0,2-0,8). Faktisk er veksthastigheter for APS Prosess I smolt betydelig større sammenlignet med industristandard-smolt plassert i sjøvann på samme sted til tross for at industristandard-smolt både var større på tidspunktet for sjøvann-plassering så vel som at deres vekst ble målt 120 dager etter sjøvannsplassering. Disse data gir bevis for at APS Prosess I smolt ikke opplevet betydelig osmoregulerende stress som ville forhindre dem fra foring umiddelbart. 3. Den raske vekst av APS Prosess I smolt umiddelbart etter havmerd-plassering gir kompounderingsøkninger i størrelsen av laks ettersom sjøvann-vekst forløper. Således er det antatt at hvis industristandard smolt som veier 112,5 gram (g) ble underkastet APS Prosess I behandling, plassert i havmerder og undersøkt etter 120 dagers havmerd-plassering ville deres størrelse være i gjennomsnitt 782 gram istedenfor 377 gram som observert. Dette gir mer enn en dobling av størrelsen av fisk i de tidlige stadier av vekst. Slik fiske ville nå markedsstørrelse raskere sammenlignet med industristandard-fisk.I motsetning til motstykket S1 smolt underkastet standard industripraksis spiste smolt behandlet med APS Prosess I godt innen 48 timer av havplassering og fortsatte å øke deres konsum av mat umiddelbart etter overføringsperioden. I sammenligning brukte industristandard-smolt lite eller intet for den første uken etter overføring. Figur 6A sammenligner det ukentlige forkonsum på en pr. fisk basis mellom Prosess I behandlet smolt og industristandard smolt. Som vist brukte Prosess I behandlet smolt omtrent to ganger så meget for pr. fisk under deres FØRST UKE sammenlignet med industristandard-smolt etter 30 dager. Siden smolt behandlet med Prosess I spiste betydelig mer sammenlignet med Industristandard-smolt, vokste prosess I behandlet smolt raskere, som vist detaljert i Eksempel 15.Figur 6B viser data for karakteristika av APS Prosess I smolt etter sjøvanns-overføring. Disse forsøk ble utført over 185 dager og disse data kan finnes i Eksempel 15 for samme fisk.Anvendelse av APS Prosess I for atlantisk laks pre-voksne fisk som er mindre enn industristandard "kritisk størrelse" smolt.Totalt ble 1400 Landcatch/St John stamme fingerling som har en gjennomsnittlig vekt på 20,5 gram anskaffet fra Atlantic Salmon of Maine Inc., Quossic Hatchery, Quossic, Maine, USA på 1. august 2000. Disse fingerling ble tatt fra en egg-klekking i januar 2000 og ansett som raskt voksende fisk. De ble transportert til behandlingsanlegget ved anvendelse av standard konvensjonell lastebil-transport. Etter deres ankomst ble disse fingerling først plassert i typiske ferskvann voksebetingelser i 14 dager. Disse fingerling ble deretter underkastet APS Prosess I i totalt 29 dager mens de ble eksponert for en kontinuerlig fotoperiode. APS Prosess I ble deretter vaksinert med Lipogen Forte produkt (Aquahealth LTD.) og transportert til havmerder med konvensjonell lastebiltransport og plassert i sjøvann (15,6°C) i enten en forsknings-havmerd som har både et predator-nett så vel som nett-åpninger små nok (0,25 tomme) til å forhindre tap av disse mindre APS Prosess I smolt. Alternativt ble APS Prosess I smolt ble plassert i sirkulære tanker i laboratoriet.48 timer etter sjøvannsoverføring ble APS Prosess I smolt startet på standard fuktig (38% fuktighet) smoltfor (Connors Bros.) som var repelletisert på grunnav nødvendigheten for å gi for med mindre størrelse for mindre APS Prosess I smolt, sammenlignet med normale industrilaks. På en måte identisk med den beskrevet for 70 gram smolt ovenfor ble dødelighet, for-konsum, vekst og total helse av disse 30 gram APS Prosess I smolt nøye overvåket.Figur 7 viser karakteristika av en representativ prøve av en større gruppe med 1209 APS Prosess I smolt umiddelbart før deres overføring til sjøvann. Disse parametere omfattet en gjennomsnittsvekt på 26,6+8,6 gram, lengde på 13,1+1,54 cm og kondisjonsfaktor på 1,12+0,06. Etter sjøvannsoverføring oppviste APS Prosess I smolt en lav innledende dødelighet til tross for det faktum at deres gjennomsnittlige kroppsvekt var 26-38% av industristandard 70-100 gram S0-S1 smolt. Som vist i Tabell 5 var APS Prosess I smolt-dødelighet innen de innledende 72 timer etter sjøvann-plassering 1/140 eller 0,07% for laboratorietank. Havmerd-dødelighet etter plassering av APS Prosess I smolt var 143/1069 eller 13,4%. Figur 7 viser representative Landcatch/St John stamme APS Prosess I smolt som har et område av kroppsstørrelse som ble overført til sjøvann enten i havmerder eller tilsvarende laboratorie-sjøvanntanker. APS Prosess I smolt har et bredt område av størrelser (f.eks. fra ca. 5,6 gram til ca. 46,8 gram kroppsvekt) med en gjennomsnittlig kroppsvekt på 26,6 gram. Forsøk med disse data ble utført i 84 dager etter overføring av fisk til sjøvanntanker og dataene fra disse forsøk er angitt i Eksempel 16.Figur 8 viser en sammenligning av distribusjon av kroppskarakteristika for total gruppe av Landcatch/St John APS Prosess I smolts vs. mortalitet 72 timer etter sjøvann havmerd-plassering. Lengde- og kroppsvekt-data oppnådd fra 143 mortaliteter som forekommer etter sjøvannsplassering av 1069 APS Prosess I smolt ble plottet mot data oppnådd fra en 100 fisk undersøkelse som vist tidligere i Figur 7. Bemerk at mortaliteter er utelukkende fordelt blant de mindre fisk i den større APS Prosess I merd-populasjon.Lengde- og vekt-målinger for alle mortaliteter oppsamlet fra bunnen av havmerden ble sammenlignet med fordeling av APS Prosess I smolt kroppskarakteristika oppnådd fra analyse av en representativ prøve tidligere vist i Figur 8. Dataene viser at mortalitetene skjedde selektivt blant APS Prosess I smolt som har små kroppsstørrelser slik at den gjennomsnittlige kroppsvekt av mortalitetene var 54% av den gjennomsnittlige kroppsvekt av totale overførings-populasjon (14,7/27 gram eller 54%). Således er den virkelige dødelighetsgrad av APS Prosess I smolt som veier 25-30 gram 0,4% (4/1069) og de som veier 18-30 gram er 2,9% (31/1069).Anvendelse av APS Prosess I for ørret pre-adult fisk som er mindre enn Industristandard "Kritisk Størrelse" Smolt.Tabell 6 viser data for anvendelse av APS Prosess I på liten (3-5 gram) regnbueørret. Unge ørret er meget mindre tolerante for brå overføringer fra ferskvann til sjøvann sammenlignet med unge atlantiske laks. Som et resultat overfører mange kommersielle sjøørret-produsenter deres fisk til brakkvann-steder lokalisert i elvemunninger eller ferskvann-lenser eller konstruerer "drikkevann" systemer for å gi fersk vann til ørret istedenfor den fulle styrke av sjøvann til stede i standard havmerder. Etter et forlenget intervall av osmotisk tilpasning blir ørret deretter overført til mer standard havmerdsteder for å fullføre deres vekstcyklus. Generelt blir ørret overført til disse havsteder for vekst ved kroppsvekt på omtrent 70-90 eller 90-120 gram.Totalt 140 ørret fra en enkel samling av fisk mindre enn 1 år gamle ble delt i grupper og holdt ved en vanntemperatur på 9-13°C og pH 7,8-8,3 for varigheten av forsøket beskrevet nedenfor. Når kontroll-ferskvanns-regnbueørret blir overført direkte til sjøvann, er det 100% dødelighet innen 24 timer (kontroll ferskvann). Eksponering av ørreten for en konstant fotoperiode i 14 dager resulterer i en liten forbedring i overlevelse etter deres overføring til sjøvann. I motsetning resulterer eksponering av ørret for APS Prosess I i enten 14 dager eller 23 dager i betydelige reduksjoner i mortaltiteter etter overføring til sjøvann slik at henholdsvis 30% og 46% av fisken har overlevd etter en 5 dager periode i sjøvann. Disse data demonstrerer at anvendelse av APS Prosess I øker overlevelse av pre-adult ørret som er mindre enn 7% av størrelsen av standard "kritisk størrelse" ørret produsert ved dagens industristandard-teknikker.Anvendelse av APS prosess I for arktisk røye pre-adult fisk som er mindre enn industristandard "kritisk størrelse" smolt.Selv om arktisk røye er laksefisk og anadrom fisk er deres toleranse for sjøvannsoverføring langt mindre sammenlignet med laks eller ørret. Figur 9 viser resultatene av eksponering av mindre røye (3-5 gram) for APS Prosess I totalt 14 og 30 dager. Alle fisk vist i Figur 9 ble eksponert for en kontinuerlig fotoperiode. Overføring av røye til sjøvann direkte fra ferskvann resulterer i død av alle fisk innen 24 timer. I motsetning gir behandling av røye med APS Prosess I i 14 og 30 dager en økning i overlevelse slik at henholdsvis 33%(3/9) eller 73% (22/30) fortsatt er i live etter 3 dagers eksponering. Disse data demonstrerer forbedring av overlevelse av arktisk røye som er mindre enn 10% av den kritiske størrelse som definert ved industristandard-metoder etter deres eksponering for APS Prosess I fulgt av overføring til sjøvann.Figur 9 viser en sammenligning av overlevelse av arktisk røye etter forskjellige behandlinger. En enkel gruppe av arktisk røye (3-5 gram ble oppnådd fra Pierce hatcheries (Buxton, ME) og enten holdt i ferskvann eller behandlet med APS Prosess I før overføring til sjøvann.SEKSJON II: Anvendelse av APS Prosess II for å tillate vellykket overføring av 10-30 gram smolt til sjøvann-merder og tanker.APS Prosess II protokoll blir anvendt for å behandle pre-voksne anadrome fisk for plassering i sjøvann med en gjennomsnittlig størrelse på 25-30 gram eller mindre. Denne metoden skiller seg fra APS Prosess I protokoll ved inklusjonen av L-tryptofan i dietten til pre-voksne anadrome fisk før deres overføring til sjøvann. APS Prosess II forbedrer ytterligere de osmoregulerende kapabiliteter av pre-voksne anadrome fisk og tilveiebringer fortsatt ytterligere reduksjoner i den "kritiske størrelse" for atlantisk laks smolt-overføring. I oppsummering reduserer APS Prosess II den "kritiske størrelse" for vellykket sjøvannsoverføring til mindre enn én femtedel av størrelsen av dagens industristandard SO-smolt.St John/St John stamme pre-adult fingerling avledet fra januar 2000 egg-klekking og som har en gjennomsnittlig vekt på 0,8 gram ble anskaffet fra Atlantic Salmon of Maine Inc. Kennebec Hatchery, Kennebec Maine 27. april 2000. Disse fiskrne ble transportert til behandlingsanlegget ved anvendelse av standard konvensjonell lastebil-transport. Etter deres ankomst ble disse parr først dyrket i konvensjonell strøm gjennom ferskvann vekstbetingelser som omfattet en vanntemperatur på 9,6°C og en standard ferskvann parr diett (Moore-Clark Feeds). Den 17. juli 2000 ble fingerling startet på APS Prosess II i totalt 49 dager mens den ble eksponert for en kontinuerlig fotoperiode. APS Prosess II smolt ble deretter vaksinert med Lipogen Forte produkt (Aquahealth LTD.) på dag 28 (14. august 2000) av APS Prosess II-behandling. APS Prosess II smolt ble størrelsesgradert før initiering av APS Prosess II så vel som umiddelbart før overføring til sjøvann. St John/St John APS Prosess II smolt ble transportert til havmerder ved konvensjonell lastebiltransport og plassert i sjøvann (15,2°C) i enten en enkel havmerd identisk med den beskrevet for plassering av APS Prosess I smolt eller i laboratorietanker (15,6°C) i forskningsanlegg.Figur 10 viser representativ St. John/St John stamme APS Prosess II smolt som har et område av kroppsstørrelser overført til sjøvann enten i havmerder eller tilsvarende laboratorie-sjøvannstankers. Bemerk at disse APS Prosess II smolt har et bredt område av kroppsvekter (3,95-28 gram) som omfatter en gjennomsnittlig kroppsvekt på 11,5 gram. Figur 10 viser karakteristika for St. John/St John APS Prosess II smolt. De gjennomsnittlige målinger av disse St. John/St. John APS Prosess II smolt omfatter en kroppsvekt på 11,50+7-5,6 gram, lengde 9,6+7-1,5 cm og kondisjonsfaktor på1,19+/-0.09. Dataene angitt i Tabell 8 viser resultatene for to grupper av APS Prosess II smolt avledet fra en enkel produksjonssamling av fisk etter deres sjøvannsoverføring til enten laboratorietanker eller havmerder. Selv om viktige variabler så som vann-temperaturer og transport av fisk til stedet for sjøvannsoverføring var identiske, opplevet disse 2 grupper av APS Prosess II smolt differensielle etter-sjøvanns-overføring mortaliteter etter 5 dager i laboratorietanker (10% dødelighet) og havmerder (37,7% dødelighet).Den sannsynlige forklaring på dette avvik i mortaliteter mellom sjøvann-laboratorietanker (10% dødelighet) og havmerder (37,7% dødelighet) er eksponering av disse fiskene for forskjellige fotoperiode-regimet etter sjøvanns-plassering. Som angitt detaljert i Eksempel 10 reduserte eksponering av unge atlantiske laks for en konstant fotoperiode etter sjøvanns-plassering deres post-sjøvannsoverførings-dødelighet fra omtrent 34% til 6%. Fisk overført til havmerder opplevet naturlig fotoperiode som ikke var kontinuerlig og led således en omtrentlig 4-ganger økning i dødelighet. Som vist i Tabell 7 viste separat sjøvannsoverføring av St John/St John unge atlantiske laks som har en gjennomsnittsvekt på 21 g bare 0,2% dødelighet etter en seks ukers behandling med APS Prosess II og undervannslys. Disse fiskene ble eksponert for en kontinuerlig fotoperiode med undervanns halogenlykter i en periode på 30 dager.Ingen klare problemer ble observert med de mindre (10-30 gram) APS Prosess II smolt som negotierer betingelsene som eksisterer innen rammene av deres havmerd. Dette omfatter mangel på klare problemer omfattende evnen til å stime fritt så vel som evnen til å svømme normalt mot de betydelige havstrømmer som kontinuerlig er til stede i det kommersielle Blue Hill Bay laks akvakultursted. Mens disse observasjoner fortsatt pågår, indikerer disse data ikke at plassering og påfølgende vekst av APS Prosess II smolt i havmerder vil kompromitteres på grunn av mangel på evne av disse pre-voksne anadrome fisk til å svømme mot eksisterende havstrømmer og derfor være ute av stand til å spise eller utvikles skikkelig.Figur 11 sammenligner karakteristika av overlevende og mortaliteter av APS Prosess II smolt etter sjøvannsoverføring til enten laboratorietanker(Figur 11 A) eller havmerder (Figur 11B). Figur 11A data er avledet fra analyser av 100 APS Prosess II smolt overført til sjøvannstank hvor alle fisk ble avlivet og analysert på dag 5. I motsetning viser Figur 11B bare dødelighetsdata fra havmerder. I begge tilfeller opplevet bare mindre APS Prosess II smolt dødelighet. Bemerk forskjeller i Y-akse skala av Figurer 11A-B.Sammenligning av den gjennomsnittlige kroppsstørrelse av APS Prosess II smolt som overlevet sjøvannsoverføring vs. de APS Prosess II smolt som døde viser at mislykkede APS Prosess II smolt hadde betydelig mindre kroppsvekter sammenlignet med gjennomsnittlig kroppsstørrelse av hele APS Prosess II smolt overføringsgruppen. Således er gjennomsnittsvekt av mortaliteter i laboratorietank (5,10+/-2,2 gram) og havmerd (6,46+/-1,5 gram) henholdsvis 44% og 56% av verdien av gjennomsnittskroppsvekt av hele overføringsgruppen (11,5 gram). I motsetning er mortalitetene av APS Prosess II smolt med kroppsvekt større enn 13 gram 0/100 i laboratorietank og 1/1316 eller 0,076% for havmerder. Sammen demonstrerer disse data at APS Prosess II kan redefinere den "kritiske størrelse" av atlantisk laks smolt fra 70-100 gram til omtrent 13 gram.Ekspansjon av ørretoppdrett er hindret av mange faktorer. Disse omfatter det faktum at unge ørret er meget mindre tolerante for brå overføringer fra ferskvann til sjøvann sammenlignet med unge atlantiske laks. Som et resultat overfører mange kommersielle sjøvørret-produsenter deres fisk til brakkvann-steder lokalisert i elvemunninger eller ferskvann lenser eller konstruerer "drikkevann"-systemer for å gi ferskvann til ørret istedenfor fullstyrke sjøvann til stede i standard havmerder. Etter en forlenget periode av osmotisk tilpasning, blir ørreten deretter overført til mer standard havmerd-steder for å fullføre deres vekstcyklus. Generelt blir ørret overført til disse havsteder for vekst ved kroppsvekter på omtrent 70-90 eller 90-120 gram.Totalt ble 2000 Donaldson-stamme ørret med en gjennomsnittsvekt på 18 gram anskaffet fra en lokal kommersiell klekkings-kilde (Pine Tree Trout Farm,Sanford, Maine, USA). De ble tatt fra en Desember 1999 eggklekking og ble overført fra ferskvann til the APS Prosess II ved 11-12°C mens de bleeksponert for en kontinuerlig fotoperiode. Den totale varighet av APS Prosess II behandling var 35 dager (21. juni - 26. juli, 2000). Etter å være vaksinert ved anvendelse av Lipogen Forte (Aquahealth LTD), ble ørreten overført direkte til en forskningsmerd inneholdende sjøvann med full styrke ved 15,6°C ved anvendelse av standard overføringsprosedyrer som beskrevet for atlantisk laks ovenfor. Den gjennomsnittlige vekt for den totale gruppe av ørret APS Prosess II var 22,7 gram som vist i Tabell 9.Mortalitetstellinger utført identisk med de beskrevet for atlantisk laks-overføringer avslørte totalt 513/1190 eller 43,1% under den innledende 5-dagers periode. Den gjennomsnittlige kroppsvekt av disse mortaliteter var 15.5+/-1,5 gram som vist på Figur 12. På en måte lignende den vist ved atlantisk laks APS Prosess I og II smolt, skjedde mortaliteter blant de mindre ørret APS Prosess II smolt mens den større fisk oppviste lite eller ingen dødsfall. Således var den gjennomsnittlige kroppsvekt av mortalitets-populasjon 15,5 gram eller 68,3% av verdien for total populasjon av ørret overført til sjøvann. Foring av ørret ble observert etter tilbud av fuktig diett-for 48 timer etter plassering i sjøvann med full styrke.Figur 12 viser fordeling av kroppsvekter og lengder blant mortaliteter av ørret APS Prosess II smolt i løpet av de innledende 5 dager etter overføring til havmerder. Bemerk at gjennomsnittsvekten av disse 515 mortaliteter er 15.5+/-1,5 gram.I oppsummering demonstrerer disse data at fordelene ved foreliggende oppfinnelse ikke er begrenset til atlantisk laks men forekommer også ved anvendelse av regnbueørret. Anvendelse av APS Prosess II smolt prosess har betydelig redusert den "kritiske størrelse" av regnbueørret for direkte sjøvann-overføring til omtrent 30 gram. Videre har den eliminert nødvendigheten for overføring av regnbueørret til brakkvann. Således lover anvendelse av of the APS Prosess II sterkt å utvide de mulige steder som kan anvendes for full styrke sjøvann overføring av regnbueørret.Kvantifisering av foring og vekst av APS Prosess I og II smolt etter sjøvann-overføring: Landcatch/St John APS Prosess I smolt ble gitt mat 48 timer etter deres sjøvannsoverføring til enten laboratorietanker eller havmerder. Mens disse APS Prosess I smolt som ble overført til laboratorietanker begynte å spise etter 48 timer, ble fiskene overført til havmerder ikke observert å spise hovedsakelig før etter 7 dager. For å validere disse observasjoner utførte oppfinnerne direkte visuell inspeksjon av tarminnholdet fra en representative prøve av 49 APS Prosess I smolt 4 dager etter deres sjøvannsoverføring til laboratorietanker. Totalt hadde 21/49 eller 42,9% mat i deres tarminnhold på det tidspunktet.St John/St John APS Prosess II smolt spiste gode når først tilbudt mat 48 timer etter deres sjøvannsoverføring uansett hvorvidt de ble anbrakt i laboratorietanker eller havmerder. En identisk direkte analyse av APS Prosess II smolt tarminnhold utført som beskrevet ovenfor viste at 61/83 eller 73,5% av fiskene spiste 4 dager etter overføring til sjøvann. Den kraftige spiseaktivitet til APS Prosess II smolt i en havmerd så vel som laboratorietanker skjedde. Tatt sammen, indikerer disse data at APS Prosess I og II smolt ikke lider av forlenget (20-40 dag) intervall av dårlig spising etter sjøvannsoverføring som er merkbar for den meget større industristandard atlantisk laks smolt ikke behandlet med fremgangsmåten.APS har kvantifisert vekstengrader av identisk fisk behandlet med enten APS Prosess I eller II i laboratorie-sjøvannstanker. Som vist i Tabell 10 vokser både atlantisk laks behandlet med APS Prosess I eller II raskt under det innledende intervall (21 dager) etter overføring til sjøvann. I motsetning til industristandard-smolt som veier 70-100 gram som spiser dårlig og således har liten eller ingen vekst i løpet av deres første 20-30 dager etter overføring til sjøvann, viste pre-adult atlantisk laks som mottar APS Prosess I eller II både vesentlige vektøkninger og vekst til tross for det faktum at de bare har 27-38%(APS Prosess I) og 12-16% (APS Prosess II) av den kritiske størrelse av industristandard smoltt. Data som angår mortalitet, SGR, temperatur-korrigert SGR (GF3), FCR, kroppsvekt, lengder og tilstandsfaktorer for disse samme fisk ble oppnådd i totalt 4 ytterligere intervaller i løpet av et intervall som nå strekker seg til 157 dager. Disse ytterligere data kan finnes i Eksempel 12.Eksempel 3. Eksponering av laksesmolt for Ca2+ og Mg2+ øker ekspresjon av PVCR i visse vev.I smolt som ble eksponert for 10 mM Ca2+ og 5,2 mM Mg2+ ble ekspresjon av PVCR funnet å øke på en måte lignende den i smolt som er ubehandlet, men blir overført direkte til sjøvann.Vev ble tatt fra enten atlantisk laks eller regnbueørret, etter bedøvelse av dyret med MS-222. Prøver av vev ble deretter oppnådd ved disseksjon, fiksert ved nedsenking i 3% paraformaldehyd, vasking i Ringers og deretter frosset i en innstøpende forbindelse, f.eks. O.C.T.™ (Miles, Inc., Elkahart, Indiana, USA) ved anvendelse av metylbutan avkjølt på tørris. Etter kutting av 8 mikron tykke vevsnitt med en kryostat, ble individuelle snitt underkastet forskjellige merkingsprotokoller. Kort angitt, ble snitt montert på objektglass: 1) blokkert med geiteserum eller serum oppnådd fra samme arter av fisk, 2) inkubert med kanin anti-CaR antiserum og 3) vasket og inkubert med peroksydase-konjugert affinitetsrenset geit antikanin antiserum. Lokasjonene av det bundete peroksydase-konjugerte geit antikanin antiserum ble visualisert ved utvikling av et rose-farget aminoetylkarbazol reaksjonsprodukt. Individuelle snitt ble montert, observert og fotografert ved standard lysmikroskopi-teknikker. Metodene anvendt for å produsere anti-PVCR antiserum er beskrevet nedenfor.Resultatene er vist i Fig. 13A -13 G, som er et sett av syv fotomikrografier som viser immunocytokjemi av epitel av proksimal tarm av atlantisk laks smolt ved anvendelse av anti-PVCR antiserum og i Fig. 14, som er en Western blot av tarm fra laksesmolt eksponert for Ca2+- og Mg2+-behandlet ferskvann, og deretter overført til sjøvann. Antiserum ble fremstilt ved immunisering av kaniner med et 16-mer peptid inneholdende proteinsekvensen kodet for av det karboksyl-terminale domene av småhai PVCR ("SKCaR") (Nearing, J. et al., 1997, J. Am. Soc. Nephrol. 8:40A). Spesifikk binding av anti-PVCR antistoff er angitt ved aminoetylkarbazol (AEC) reaksjonsprodukt.Fig. 13A og 13B viser merket intestinalt epitel fra smolt som var holdt i ferskvann og deretter overført til sjøvann og holdt for en periode på 3 dager. Rikelig PVCR-immunmerking er tydelig i celler som kanter den luminale overflate av tarmen. Den høyere forstørrelse (1440X) vist i Fig. 13B viser PVCR-protein lokalisert til den apikale (luminal-vendende) membran av intestinale epitelceller. Mønsteret av PVCR-merking er lokalisert til den apikale membran av epitelceller (små pilhoder) så vel som membraner i globulare runde celler (piler). Fig. 13C viser merket intestinalt epitel fra en representativ smolt som ble eksponert for APS Prosess I og holdt i ferskvann inneholdende 10 mM Ca2+ og 5,2 mM Mg2+ i 50 dager. Bemerk at mønsteret av PVCR-merking ligner mønsteret vist av epitelceller angitt i Figurer 13A og 13B omfattende apikal membranmerking (små pilhoder) så vel som større globulære runde celler (piler). Fig. 13D viser en 1900X forstørrelse av PVCR-merket intestinalt epitel fra en annen representativ fisk som ble eksponert for APS Prosess I og holdt i ferskvann inneholdende 10 mM Ca2+ og 5,2 mM Mg2+ i 50 dager og matet med 1% NaCI i dietten. Igjen betyr små pilhoder og piler PVCR- merking av henholdsvis apikal membran og globulære celler. I motsetning til den fremtredende PVCR-merking vist i Figurer 13A-D, viser Fig. 13E (1440X) og 13F (1900X) merking av intestinalt epitel fra to representative smolt som ble holdt i ferskvann alene uten supplering av Ca2+ og Mg2+ eller diett NaCI. Både 13E og 13F viser en markert mangel på betydelig PVCR-merking. Fig. 13 G (1440X) viser mangel på noen klar PVCR-merking etter substitusjon av preimmunt serum på en seksjon svarende til den vist i Figur 13A hvor anti-PVCR-antiserum identifiserte PVCR-protein. Mangel på PVCR-merking er en kontroll for å demonstrere spesifisiteten av anti-PVCR antiserum under disse immunocytokjemi-betingelsene.Den relative mengde av PVCR-protein til stede i intestinale epitelceller fra ferskvann-smolt (Figs. 13E og 13F) var neglisjerbar som vist ved den svake merking av selekterte intestinal-epitelceller. I motsetning ble PVCR-protein-innhold av de tilsvarende intestinale epitelceller betydelig øket ved overføring av disse smolt til sjøvann (Figs. 13A og 13B). Det er viktig at PVCR-protein-innhold også ble betydelig øket i intestinale epitelceller fra smolt holdt i ferskvann supplert med Ca2+ og Mg2+ (Fig. 13C og 13D). AEC-merking var spesifikk for tilstedeværelse av anti-PVCR antiserum, siden substitusjon av immunt antiserum med det preimmune eliminerte alt reaksjonsprodukt fra intestinal epitelcelle-snitt (Fig. 13 G).Beskrivelse av lokalisering av PVCR protein(er) i ytterligere områder av osmoregulerende organer av atlantisk laks ved anvendelse av paraffinsnitt. Demonstrasjon av at PVCR-proteiner er lokalisert på både apikale og basolaterale membraner av intestinale epitelceller.Ved anvendelse av metodene beskrevet her ble immunolokaliseringsdata fra paraffinsnitt av forskjellige osmoregulerende organer av sjøvann-tilpasset ung atlantisk laksesmolt oppnådd. PVCR-proteiner, som bestemt ved binding av et spesifikt anti-PVCR antistoff, var til stede i de følgende organer. Disse organer er viktige for forskjellige osmoregulerende funksjoner. Disse organer omfatter spesifikt nyre-tubuler og urinblære ansvarlig for prosessering av urin og valgt celler fra skinnet, de nasale lameller og gjellene som hver er badet i vannet som omgir fisken. PVCR ble også sett i forskjellige deler av G.I.-trakten omfattende mage, pylorisk caeca, proksimal tarm og distal tarm som prosesserer sjøvann inntatt av fisken. Disse vev ble analysert etter behandling med APS Prosesser og etter deres overføring fra ferskvann til sjøvann. I tillegg er det antatt at PVCR-protein også kan virke som en næringsmiddel-reseptor for forskjellige aminosyrer som er angitt å være til stede i mage, proksimal tarm, pylorisk caeca.Spesielt ble ble større forstørrelsesbilder av PVCR-immunolokalisering i valgte celler fra mave, proksimal tarm og pylorisk caeca oppnådd. PVCR-protein er ikke bare til stede på både de apikale (luminalt vendende) og basolaterale (blod-vendende) membraner av mage-epitelceller lokalisert ved basen av mavesekken, men er også er til stede i nevroendokrine celler som er lokalisert i det submukosal område av maven. Fra dens lokasjon på nevroendokrin celler i G.l. trakten, kan PVCR-protein føle den lokale omgivelse umiddelbart tilstøtende intestinale epitelceller og modulere sekresjon og syntese av viktige G.l.-trakt-hormoner (f.eks. 5-hydroksytryptamin (5-HT), serotonin eller cholecystokinin (CCK)). Det er antatt at bestanddelene av APS Prosess II påvirker G.l. nevroendokrine celler ved minst to midler. Den første måten som bestanddeler av APS Prosess II remodellerer G.l endokrint system er gjennom endringer i ekspresjon og/eller sensitivitet av PVCR uttrykt av disse celler. Den andre måten er å tilføre store mengder av forløper-forbindelser, for eksempel tryptofan som blir omdannet til 5-HT og serotonin av metabolsk enzymer i G.l.På lignende måte er PVCR-protein lokalisert til både de apikale og basolaterale membraner av epitelceller som forer den proksimale tarm. Fra deres respektive lokasjoner kan PVCR-proteiner føle både luminalt og blod-innhold av divalente kationer, NaCI og spesifikke aminosyrer og derved integrere de multiple næringsmiddel- og ion-absorptive sekretoriske funksjoner intestinale epitelceller. Epitelceller fra pylorisk caeca har også rikelig apikalt PVCR-protein.For videre å demonstrere spesifisiteten av anti-CaR antiserum til å gjenkjenne laksesmolt-PVCR, viser Fig. 14 et Western blot av intestinalt protein fra laksesmolt holdt i 10 mM Ca2+, 5 mM Mg2+ og matet 1% NaCI i dietten. Deler av proksimal og distal tarm ble homogenisert og oppløst i SDS-inneholdende buffer, underkastet SDS-PAGE ved anvendelse av standard teknikker, overført til nitrocellulose og like mengder av homogenat-proteiner som bestemt ved både proteinforsøk (Pierce Chem. Co, Rocford, IL) så vel som Coomassie Blue merking ble probet for tilstedeværelse av PVCR ved anvendelse av standard Western blottingsteknikker. Resultatene er vist i venstre spor, merket "CaR" og viser et bredt bånd på ca. 140-160 kDa og mange høyere molekylvekt-komplekser. Mønsteret av PVCR-bånd er lignende det tidligere angitt for hainyre (Nearing, J. et al., 1997, J. Am. Soc. Nephrol. 8:40A) og rottenyre indre medullære oppsamlingstrakt (Sands, J.M. et al., 1997, J. Clin. Invest. 99:1399-1405). Sporet til høyre ble behandlet med det preimmune anti-PVCR serum anvendt i Fig. 13 G og viser en fullstendig mangel på bånd. Tatt sammen med immunocytokjemi-data vist i Figur 13, demonstrerer dette immunoblot at antiserumet anvendt er spesifikt for detektering av PVCR-protein i laks.Eksempel 4. Eksponering av ørret-fingerling for Ca2+ og Mg2+ øker ekspresjon av PVCR.Utvikling av spesifikke ionetransport-evner i epitelceller fra gjeller, nyre og intestinalt vev er viktig for pre-voksne anadrome fisk hvis de skal overleve overføring til sjøvann. For å bestemme om endringer i PVCR-ekspresjon ledsaget økning i ørret-fingerling-overlevelse i sjøvann, ble immunoblotting og immunocytokjemi utført på prøver fra fingerling, som utført for laksesmolt-vev. Resultatene er vist i Fig. 15,16 og 19. Fig. 15 er et immunoblot av intestinalt vev fra ørret-fingerling. Anti-CaR antiserum identifiserer multiple bånd som er spesifikk for PVCR-merking som bestemt ved sammenligning av immune (spor markert CaR) vs. preimmune (spor markert pre-immune). Prominent blant disse bånd er et bredt bånd på 120-160 kDa, sammen med større molekylvekt komplekser til stede ovenfor disse bånd fra både tarm- og gjelle-vev. Fig. 16A, 16B, 16C, 16D, 16E, 16F, 16 G og 16H er et sett på åtte fotomikrografier som viser immunocytokjemi av epitel fra den proksimale tarm av regnbueørret ved anvendelse av anti-PVCR antiserum. Fig. 16A, 16C and16E viser prøver fra ørret holdt i ferskvann alene, mens Fig. 16B, 16D, 16F, 16 G og 16H viser prøver fra ørret holdt i ferskvann supplert med 10 mM Ca2+ og 5,2 mM Mg2+ og matet en 1% NaCI-diett. Proksimale intestinale segmenter er vist i Fig. 16A-16D og 16 G-16H, mens distale intestinale segmenter er vist i Fig. 16E-16F. Fig. 16A-16F ble behandlet med immun kanin anti-CaR antiserum, vasket og utviklet med pepperrot peroksydase-konjugert geit anti-kanin antiserum ved anvendelse av en aminoetylkarbazol-(AEC) reaksjon. Mens Figurer 16A, 16C og 16E viser liten eller ingen PVCR-merking, viser Figurer 16B, 16D og 16F betydelig PVCR-merking som er til stede på den apikale membran av celler som forer intestinal lumen (små pilhoder) så vel som større globulære runde celler (piler). I motsetning til snitt eksponert for immunt anti-PVCR antiserum, ble Figur. 16H behandlet med pre-immun kanin anti-CaR antiserum og inneholder således ikke farget AEC reaksjonsprodukt. Disse data indikerer at denne metoden spesifikt detekterer PVCR-protein bundet til anti-PVCR antiserum. Fig. 16 G ble merket direkte med Alcian blue (Sheehan, D.C. et al., 1980, Theory and Practice of Histochemistry, Battelle Press, Columbus, Ohio, USA) for å lokalisere mucin-produserende epitelceller som er til stede i tarm. Bemerk at fremkomst av cellemerking for PVCR-protein i Figurer 13D (vist ved små piler) viser en lignende morfologisk fremtreden som de merket med Alcian blå i Figur 13 G. Disse data indikerer at PVCR er uttrykt ved mucin-produserende celler i tarmen hvor PVCR-signalerings-virkninger modulerer mucin-produksjon i tarmen.Immunocytokjemi av intestinalt vev viser at innholdet av PVCR-protein er forskjellig i ørret holdt i ferskvann alene (Figurer 16A, 16C og 16E) vs. ferskvann supplert med Ca2+ og Mg2+ og ørret matet en NaCI-supplert diett (Figurer 16B, 16D, 16F). Normalt i ferskvann er PVCR-ekspresjon lav i både proksimale (Fig. 15A og 16C) eller distale (Fig. 16E) snitt av tarm. Imidlertid er PVCR-ekspresjon betydelig øket i både proksimale (Fig. 16B og 15D) og distale segmenter (Fig. 15F) etter eksponering for ferskvann supplert med 10 mM Ca2+ og 5,2 mM Mg2+ og foring med NaCI-supplert diett.Mens PVCR-protein er lokalisert til mange regioner av multiple celler, er tilstedeværelse av intens merking på apikale membraner av intestinale epitelceller (små pilhoder) så vel som leilighetsvis rundede celler (store pilhoder) er identisk med data som lokaliserer PVCR-protein i både småhai (Nearing, J. et al., 1997, J. Am. Soc. Nephrol. 8:40A), så vel som rottenyre indre medullære oppsamlingstrakt (IMCD) (Sands, J.M. et al., 1997, J. Clin. Invest. 99:1399-1405). Som beskrevet ovenfor for atlantisk laksesmolt, blir apikal PVCR i ørret-tarm fremkalt ved økninger i luminale Ca2+ og Mg2+ konsentrasjoner og derved regulerer NaCI-mediert gjenvinning av vann fra intestinalt innhold. Denne gjenvinning er viktig for overlevelse av marin fisk (Evans, D.H., 1993, "Osmotic and lonic Regulation," i: The Physiology of Fishes, ed. D.H. Evans, CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, kap. 11, s. 315-341), ettersom den erstatter osmotisk vanntap som skjer via skinnet og gjellene.Anti-PVCR-merking av rundede celler, som er spredd gjennom hele de større intestinale epitelceller (Fig. 16D) er også i overensstemmelse med at disse celler svarer til mucin-produserende celler som er kjent å merkes intenst med Alcian Blue (Sheehan, D.C. et al., 1980, Theori and Practice of Histochemistry, Battelle Press, Columbus, Ohio, USA) (Fig. 16 G).Figur 17 viser et representativt immunoblot som sammenligner de totale nivåer av PVCR-innhold av protein-homogenater fremstilt fra gjellevev fra ørret ved anvendelse av samme anti-PVCR antiserum som beskrevet i Figurer 13-15. Før disseksjon og homogenering av gjellevev, ble ørret eksponert for 1 av 3 forskjellig behandlinger omfattende enten ferskvann, ferskvann med 10 mM kalsium og 5,2 mM magnesium med diettær NaCI-supplering eller ferskvann med bare diettær NaCI-supplering. I gjellene identifiserer anti-PVCR antiserum også et bredt 120-140 kDa og et bånd av stor molekylær masse (større enn 200 kDa) som er lignende de vist i Figurer 14 og 15. Disse data er i overensstemmelse med molekylære masser av CaR med kjent struktur og lignende de observert i immunoblottings-analyser av multiple organismer, omfattende rotte (Sands, J.M. et al., 1997, J. Clin. Invest. 99:1399-1405), flyndre og hai (Nearing, J. et al., 1997, J. Am. Soc. Nephrol. 8:40A). Et moderat nivå av PVCR-ekspresjon i gjeller som definert ved PVCR reaktivt bånd forekommer når ørret blir holdt i ferskvann (ferskvann). Omfanget av PVCR- protein blir øket når ørret blir eksponert for APS Prosess I (Ca, Mg + NaCI suppl. for) som vist i det midtre spor (Ca, Mg). I motsetning, når ørret blir holdt i ferskvann og matet en NaCI-diett uten eksponering for kalsium og magnesium i ferskvannet, er det ingen forandring i den totale PVCR-merkings-intensitet men heller et skift av PVCR-reaktivitet fra 120 kDa til det større 200 kDa høyere molekylvekt bånd (spor markert salt). Disse data demonstrerer at eksponering av ørret for APS Prosess I (ferskvann inneholdende 10 mM kalsium, 5 mM magnesium og diettær NaCI-supplering) øker PVCR-ekspresjon i gjellevev sammenlignet med ferskvann alene. Foring med NaCI-supplert diett mens ørreten blir holdt i ferskvann produserer ikke lignende øket ekspresjon av PVCR-protein.Dataene vist i Eksempel 21 indikerer at PVCR-proteinet til stede på gjelle klorid-celler responderer på behandling av fisk med APS Prosess II og remodellerer både fordeling og Na+ K+ ATPase-aktivitet til kloridceller på en måte som nært ligner prosessen etter at fisk blir overført til sjøvann. Denne behandling av anadrome fisk med APS Prosess II tilveiebringer raskere tilpasning og bedre ytelse og vekst etter overføring av unge atlantiske laks til sjøvann.Eksempel 5: Immunolokalisering av polyvalent kation-reseptor (PVCR) i mukøse celler fra epidermis og hjernen av laks.Skinn-overflaten av laksefisk er ekstremt viktig som en barriere for å forhindre vannopptak eller tap avhengig av hvorvidt fisken er lokalisert i fersk-ener sjøvann. Således ville tilstedeværelse av PVCR-proteiner i valgte celler av fiskens epidermale lag være i stand til "å føle" saltinnholdet i det omgivende vann når det strømmer forbi og gi anledning til kontinuerlig remodellering av laksefiskens skinn basert på sammensetningen av vannet hvor det er lokalisert.Metoder: Prøver av skinnet fra unge atlantiske laks som har levet i sjøvann i over 12 dager ble fiksert i 3% paraformaldehyd oppløst i buffer (0,1M NaP04, 0,15M NaCI, 0,3M sukrose phi 7,4), manuelt avskjellet, skyllet i buffer og frosset ved -80°C for kryoseksjonering. Ti mikron snitt ble enten anvendt for immunolokalisering av PVCR ved anvendelse av anti-hai PVCR antiserum eller merket direkte med 1% Alcian Blue farge for å lokalisere celler inneholdende sure glykoprotein-komponenter av slim.Resultater og omtale: Figur 18A viser at lakse-epidermis inneholder multiple Alcian Blue merkeceller til stede i de forskjellige skinn-lag. Bemerk at bare en del av noen større celler (som inneholder sure muciner) merker med Alcian Blue (vist ved åpne pilhoder). For orienteringsformål, bemerk at skjellene er fjernet så stjerner betyr overflate som tidligere var badet i sjøvann. Figur 18B viser immunolokalisering av lakseskinn PVCR-protein som er lokalisert til multiple celler (angitt ved pilhoder) i det epidermale lag av skinnet. Bemerk at anti-PVCR merking viser helcelle-legeme, som er større enn dens tilsvarende apikale del som merkes med Alcian Blue som vist i Figur 18A. Tilstedeværelsen av bundet anti-CaR antistoff er angitt ved rose-farget reaksjonsprodukt. Selv om formell kvantifisering ennå ikke har vært utført på disse snitt, vises et at antallet PVCR-celler er mindre enn det totale antall av Alcian Blue positive celler. Disse data indikerer at bare et subsett av Alcian Blue positive celler inneholder rikelig PVCR-protein. Figur18C i Figur 18 viser kontroll preimmune snitt hvor det primære anti-CaR antiserum ble utelatt fra merkingsreaksjonen. Bemerk fravær av rosefarget reaksjonsprodukt i fravær av primært antistoff.Disse data demonstrerer tilstedeværelse av PVCR-protein i adskilte epitelceller (sannsynligvis mucocytter) lokalisert i epidermis av unge atlantiske laks. Fra denne lokasjon kunne PVCR-protein "føle" saltinnholdet i det omgivende vann og modulere mukøs produksjon via endringer i sekresjonen av slim eller proliferasjon av mukøse celler i skinnet selv. PVCR-agonister (Ca2+, Mg2+) til stede i det omgivende vann aktiverer disse epidermale PVCR-proteiner under perioden når smolt blir eksponert for fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. Denne behandling av atlantisk laksesmolt ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er viktig for å øke overlevelse av smolt etter deres overføring til sjøvann.PVCR protein kan være spesifikt lokalisert til hjernens stammeområde av atlantisk laks ved anvendelse av immunocytokjemi og antistoff dyrket mot en peptidsekvens funnet i karboksyl terminalen av hai PVCR. Disse data er i overensstemmelse med en rolle for en PVCR i moduleringen av endokrin funksjon så vel som appetittkontroll i atlantisk laks.Lokalisering av ekspresjonen av kalsiumreseptorer til spesifikke regioner av pattedyrhjerne er bestemt. Mens nøyaktige funksjoner av pattedyr-CaRs i mange regioner av pattedyrhjerne fortsatt er ukjent, indikerer mange linjer av bevis at CaRs kan integrere endringer i systemisk kalsium, natrium og vannmetabolisme med moduleringer i hjernefunksjon som omfatter forskjeller i sekresjonen av hormoner så som adrenokortikotropin (ACTH) fra hypothalamus så vel som oppførsels endringer så som regulering av tørst eller spising. Av betydning for beskrevne funn detaljert nedenfor, er PVCRs (CaRs) roller i endring av endokrin funksjon, drikking og appetitt i anadrome fisk som gjennomgår overføring fra ferskvann til sjøvann viktig.Hos pattedyr-hjerne, er det prominent CaR ekspresjon i det subfornikale organ eller SFO. SFO er et nøkkel hypothalamisk tørstsenter og er antatt å spille en rolle i modulering av drikkeaktivitet for å integrere kroppskalsium og vannhomeostase. Stimulering av drikkeoppførsel ved systemisk hyperkalsemi via stimulering av CaRs lokalisert i SFO er antatt å minimalisere dehydratiseringen produsert av endringer i nyrefunksjon som sløver den tubulare reabsorpsjon av filtrert vann av nyren. Det ekvivalente SFO område av fiskehjerne har ikke tidligere vært identifisert.I pattedyrhjerne, er det prominent CaR ekspresjon i pons-området av hjernestammen spesielt rundt området postrema nær den tredje ventrikkel. Området postrema er kjent å være en samling av neuroner antatt å mediere appetitt og er betegnet "kvalmesenteret". Fra denne delen av pattedyrhjerne, gir neuronale baner integrering av sensoriske input fra vestibular funksjon (balansesans) så vel som visuell input via baner fra optiske nerver og deres respektive kjerner i hjernen. Denne region av hjernen er antatt å være intimt involvert i kvalme produsert av hyperkalsemi så vel som administreringen av opiater til mennesker. Det ekvivalente område postrema i fiskehjerne er ikke tidligere identifisert.En kombinasjon av fysiologiske og anatomiske data gir bevis for rollen til CaRs til å integrere en rekke endokrine funksjoner med endringer i serum kalsiumnivåer hos mennesker. Intravenøs infusjon av kalsium tilstrekkelig til å øke serum kalsiumkonsentrasjoner forårsaker selektive økninger i gonadotropisk frigjørende hormoner og tyroidfrigjørende hormon (TRH) så vel som ACTH som er produsert av den anteriore hypofyse. Den fremre hypofysen er kjent å være intimt forbundet med spesifikke områder av hypothalamus som uttrykker CaRs.Økninger i serum kalsiumkonsentrasjoner av mennesker forårsaker multiple endringer i både oppførsel så vel som endokrin funksjon. Således, forårsaker hyperkalsemi øket drikking, redusert matkonsum og endringer i de sirkulerende nivåer av spesifikke hypothalamisk hormoner. Som nevntnedenfor, forekommer analoge endringer i oppførsel og sirkulerende hormonnivåer i preadult anadrome fisk under smoltfikasjon og overføring fra ferskvann til sjøvann.Hele hjerner oppnådd fra preadult atlantisk laks (St. John/St John APS Prosess II smolts) som ble underkastet APS Prosess II og overført til sjøvann ble dissekert fri for sine omgivelser og fiksert i 3% paraformaldehyd (PFA) i buffer [identisk med andre immunocytokjemi beskrivelser]. Åtte mikron snitt ble kuttet, festet til glass plater og prosessert for immunocytokjemi ved anvendelse av enten nonimmune kontroll antiserum eller anti-PVCR av dogfish hai. Spesifikk antistoffbinding ble detektert ved rose-fargete reaksjon produkt dannet fra virkningen av pepperrot peroksydase konjugert geit anti-kanin sekundær antiserum og aminoetylkarbazol. Snitt ble observert og fotografert ved anvendelse av standard lysmikroskopiEtter undersøkelse av seriesnitt fra multiple preadult atlantiske laks, er det konsistent lokalisering av PVCR protein i celler lokalisert i minst 7 distinkte regioner av laksehjerne. Den første regionen av PVCR lokalisering er distinkt merking av neuroner i vagal-lapp regionen. Den andre regionen av PVCR merking er innen neuroner i den kommissurale kjerne av Cajal. Begge disse regioner av laksehjerne er kjent for å representere viktige kjerner i smaksevnen (føle mat og spising) så vel som generelle viskerale aktiviteter omfattende spiserør og intestinal motilitet (prosessering av mat og intestinalinnhold for næringsmiddel og vann reabsorpsjon). Ekspresjon av PVCR protein linker endringer i både serum og CNS kalsiumkonsentrasjoner til endringer i spising og prosessering av intestinalinnhold viktig for anadrome fisks adapsjon til sjøvann.Et tredje sete av PVCR lokalisering i laksehjerne er saccus vasculosus hvor PVCR proteinet blir fordelt gjennom multiple celletyper. Saccus vasculosus er ovid og lokalisert på den ventrale overflate av hjernen mellom de nedre lapper. Denne struktur er meget vaskularisert og inneholder forbindelser mellom cerebral spinalfluid og det vaskulære rom. Videre, har neuroner til stede i saccus vasculosus massive nerveprojeksjoner som kanaliserer til den subependymale region av thalamus. Saccus vasculosus systemet modulerer funksjonen av sentere av den posteriore tuberkel og periventrikulær thalamus. Disse områder av hjernen er umiddelbart i nabostilling til hypofysen.Lokaliseringen av PVCR proteiner i hjernen til preadult atlantisk laks tilveiebringer bevis for at PVCR kan medvirke i en rekke funksjoner i sentralnervesystemet av anadrome fisk på en måte lignende den beskrevet ovenfor for pattedyrhjerne. Spesielt, lokalisering av PVCR til kjerner som er del av smaksevnesystemet i atlantisk laks indikerer at PVCR protein er uttrykt i neuroner som modulerer appetitt lignende den beskrevet for området postrema hos pattedyr. Stimulering av PVCR eller endringer i dens ekspresjon via endringer i serum kalsium, magnesium eller natriumkonsentrasjoner som demonstrert for atlantisk laks i denne applikasjon ville deretter være i stand til å modulere appetitt og matkonsum. Alternativt, kan endringer i cerebral spinalfluid-konsentrasjon av disse ioner via utveksling mellom CSF og det vaskulære systemet også medvirke. Siden atlantisk laks smolt produsert av dagens industri standardmetoder erfarer et intervall av uttrykt anoreksi etter deres overføring til sjøvann, kan denne velkjente undertrykking av appetitt være mediert gjennom PVCRPå lignende måte, kan PVCR signaleringsbaner også modulere både drikkeoppførsel og hypofyse- hormonsekresjon. PVCR protein uttrykt i saccus vasculosus kan gi både initiering av drikking av sjøvann av atlantisk laks og kan være direkte analoge for å øke drikking hos pattedyr forårsaket av hyperkalsemi. Økninger i serum kalsium, magnesium og natriumkonsentrasjoner produsert av overføring av preadult anadrome fisk fra ferskvann til sjøvann kan også være stimulus for øket sekresjon av hypothalamiske hormoner så som ACTH. ACTH stimulerer sekresjonen av kortisol fra binyre i fisk. Kortisol er ét hormon som er vist å være en modulator av ionetransportaktivitet og involvert i modulering av parr-smolt transformasjon i anadrome fisk. Modulering av hypofyse-aktivitet via forbindelser mellom saccus vasculosus, hypothalamus og hypofysen kan modulere disse endokrine endringer.PVCR-proteiner i ytterligere områder av hjernen og hjerne-assosierte strukturer av ung atlantisk laks omfattende stilk av pineal kjertel, luktenerve og luktekolbe og prolaktin-produserende celler av hypofysen ble lokalisert. I tillegg til de tre områder av hjernen hvor PVCR ble lokalisert, indikerer ytterligere data som ble oppnådd at PVCR er uttrykt i minst fire andre hjerneregioner eller vev forbundet med hjernen som er kjent å være nøkkelregulatorer av anadrome fiskesmolts sjøvannsytelse.Dataene oppnådd fra denne lokalisering viser at neuroner til stede i den magnocellulære kjerne, luktelappen og -nerven så vel som pineal stilk av sjøvanns tilpasset juvenil atlantisk laks uttrykker rikelige mengder av PVCR protein. I motsetning, har multiple andre hjernekjerner i hjernen ikke noe detekterbart PVCR protein. Tilstedeværelsen av PVCR protein i den magnocellulær kjerne av hjernen er sannsynlig på grunn av den foreslåtte involvering av denne kjernen som en regulator i drikkeoppførselen til fisk. Således, kan endringer i serum Ca2+, Mg2+ eller NaCI-konsentrasjoner være følt av neuroner som har PVCR og drikkeoppførselen nødvendig for overlevelse etter sjøvannsoverføring ville være initiert. På lignende måte, kan tilstedeværelsen av PVCR protein i både luktelappen og luktenerven tillate modulering av neuronale input fra lukt lamellae (føle ioniske og næringsmiddelkonsentrasjoner i det omgivende vann) med kjerner til andre regioner av hjernen basert på føling av serumkonsentrasjoner av Ca2+, Mg2+ eller NaCI. Kalsium-ioner spiller en nøkkelrolle i dannelse av det lys-modulerte hormon, melatonin, fra fisk pinealkjertel. Således, føler neuroner som uttrykker PVCR protein tilstede i stilk av pinealkjertel konsentrasjonene av serum Ca2+, Mg2+ eller NaCI og gir derved integrering mellom signaler dannet ved fotoperiodee eksponering, melatoninsyntese og endringer i kroppssammensetningen til juvenil atlantisk laks. Dette systemet kan lette virkningene av fotoperiodee etter sjøvannoverføring i Prosess 11-behandlet fisk som detaljert i Eksempel 10.Immunolokaliseringsundersøkelser av hypofysen til juvenil(ung) atlantisk laks avslører prominent ekspresjon av PVCR protein i prolaktin-produserende celler av adenohypofysis. Merking av serie snitt av en enkel hypofyse- med enten anti-PVCR antiserum eller anti-veksthormon antiserum ble oppnådd og analysert. Dataene oppnådd viser at bare prolaktin-produserende celler har PVCR protein mens nabostilte veksthormon-produserende celler ikke har noe detekterbart PVCR protein. Disse data er i overensstemmelse med den prominente rolle av prolaktin som et nøkkelhormon i regulering av kroppssammensetning til salmonider (laksefisk) i ferskvann. Videre, virker prolaktin som en antagonist av den sjøvann-promoterende virkning av veksthormon. Disse data indikerer at prolaktin, i naturen, beskytter ung laks i intervallet umiddelbart før sjøvannsoverføring ved å antagonisere virkningen av veksthormon som ville akselererer remodelleringen av fisken's vev for liv i sjøvann. Tilstedeværelsen av PVCR protein i prolaktin-produserende celler i hypofysen til ung atlantisk laks tillater disse celler å føle den nøyaktige tid som fisk blir overført til sjøvann via endringer i serum Ca2+, Mg2+ eller NaCI som demonstrert i Eksempel 7. Reduksjon i frigjøringen og/eller syntese av prolaktin reduserer konsentrasjoner av sirkulerende prolaktin og således reduseres prolaktin's antagonisme av veksthormon tillatende ung laks til å adaptere fullstendig til sjøvann. Eksponering av fisk til APS Prosess I eller II endrer serum Ca2+, Mg2+ eller NaCI på en måte lignende den til sjøvannsoverføring og preparerer fisk for deres overføring til sjøvann. Eksempel 7: Serumnivå i fisk eksponert for APS Prosess I eller APS Prosess IIDataene beskrevet her demonstrerer at endringer i konsentrasjonene av kalsium, magnesium og NaCI i kroppsfluider til anadrome fisk forekommer etter sjøvanns overføring og svært høye konsentrasjoner forårsaker eller bidrar til post sjøvanns overføring dødsfall i anadrome fisk. APS Prosess II etterligner sjøvannsoverføring uten å utsette små preadulte anadrome fisk for osmotisk stress. Denne behandlingen av fisk tillater dem således å bli overført til sjøvann ved betydelig mindre størrelser og under betingelser som er ikke-PVCRs er til tede i multiple vevslokasjoner hvor PVCRs er eksponert for omgivende sjøvann (gjeller, hud), luktelamella, luminalinnhold av tubules (nyre, intestin) så vel som indre kroppsvæskeer (hjerne, endokrint vev, muskel). Når anadrome fisk blir overført fra fersk- til sjøvann er det en abrupt økning i de ytre vannkonsentrasjoner av kalsium, magnesium og NaCI. Hvis fisken absorberer øket mengder av kalsium, magnesium og NaCI via drikking eller osmose så vil PVCRs lokalisert på de apikale overflater av tarm (intestinal)- og nyreepitelceller være eksponert for å økede mengder av disse divalente og monovalente ioner. Disse økninger i divalent kation-konsentrasjoner forekommer siden nyren er det primære ekskresjonsorgan for divalente kationer og tarmen er hovedorganet for vanngjenvinning i anadrome fisk via prosesseringen av inntatt sjøvann. Viktig for denne databeskrivelse er det faktum at hvis konsentrasjonene av kalsium, magnesium og NaCI øker i blodet og ekstracellulær væske i fisk, så vil PVCRs som er badet i disse kroppsvæsker bli stimulert. Endringer i serum kalsium og magnesium utgjør en aktuell signaliseringsbane. I dette henseende, er det også verd å legge merke til at det er et vidt område av "normal"-verdier for serumkonsentrasjoner av kalsium, natrium, magnesium og klorid i anadrome fisk. Mens det har vært erkjent at "steady state" serumkonsentrasjoner av disse ioner forandres med forskjellige saliniteter (saltkonsentrasjoner), er det ikke noen erkjennelse av at disse kan representere fisk med ulike PVCR "set points" som beskrevet her.Nåværende produksjonsmetoder for salmonider avhenger av oppnåelse av en "kritisk størrelse" for preadult fisk betegnet smolt som gjør dem i stand til å overleve overføringen fra ferskvann til sjøvann.Fremstilling av salmonider for akvakultur er avhengig av evnen for preadult fisk til å overleve direkte overføring fra ferskvann til sjøvann. For denne prosessen til å forekomme, har dagens industrimetoder identifisert en "kritisk størrelse" for hver art av laksefisk. Under denne kritiske størrelsen, er mange fisk ikke i stand til å overleve de dramatiske endringer i vannosmolalitet og ionisk sammensetning. Faktorer som bidrar til evnen til "kritisk størrelse" smolt omfatter spesifikt overflateareal til volumforhold så vel som modenhet av ionisk transport og hormonelle mekanismer til å ta seg av de nye sjøvann ioniske omgivelsene. Disse mekanismer involverer koordinerte responser fra mange organer omfattende gjellene, mage-tarm-kanal, nyre og hud så vel som spesifikke oppførsels endringer så som initiering av drikkeoppførsel etter sjøvanneksponering. Overføringen av en fisk fra en ferskvann- til en sjøvannomgivelse utgjør en hovedutfordring for disse osmoregulerende systemer som raskt remodelleres for å tillate dens overlevelse. De grunnleggende osmoregulerende mekanismer og responser er beskrevet kort iNår en fisk oppholder seg i ferskvann, er den omgitt av en vandig omgivelse som har et betydelig lavere ionisk og osmotisk innhold (Tabell 11). På grunn av den osmotiske gradienten som eksisterer mellom kroppsvæsken til fisken og det omgivende miljø, tar fisken konstant til seg vann som kontinuerlig truer med å fortynne det mer konsentrerte ioniske innhold av fiskens kroppsvæsker. Som et resultat, drikker ikke ferskvannsfisken eller utskiller ikke en rikelig fortynnet urin. for å forhindre tap av viktige kroppssalter til omgivelsen, deltar gjellene, mage-tarm-kanalen så vel som nyretubules i aktivt opptak av ioner fra enten deres luminalinnhold eller det omgivende ferskvann.I motsetning, har når en fisk oppholder seg i sjøvann den omgivende vandig omgivelse et betydelig større ionisk og osmotisk innhold sammenlignet med fiskens egen kroppssammensetning (Tabell 11). Som vist i Figur 19, mister marine salmonid konstant kroppsvanninnhold til det omgivende sjøvann. I dette henseende, er både integriteten og permeabilitet til fiskens hudlag viktige i reduksjon av disse hud-tap til så lavt som mulig. For å erstatte disse pågående vanntap, drikker fisken sjøvann og prosesserer det på en slik måte for å beholde vann og bare en del av dets konstituente ioner. Inntatt sjøvann prosesseres av epitelceller som bekler mave-tarm-kanalen. I denne prosessen, er tarmopptak av vann og noe NaCI av fisken tillatt mens Ca2+ og Mg 2+ er enten ikke absorbert eller utskilt av nyretubules. Absorbert NaCI pumpes fra fiskens kropp via gjelleepitelceller.Figur 19 sammenligner adaptive endringer til stede i fisk i ferskvann vs sjøvann. Spesifikke fysiologiske adapsjoner til stede i ferskvannsfisk er vist skjematisk i det venstre panel. I motsetning, vises endringer i disse samme fysiologiske responser når fisk er i sjøvann til høyre.Det er viktig for den før-voksne anadrome fisk å oppnå alle disse adaptative endringer raskt etter overføring fra ferskvann til sjøvann. Utvikling og modning av disse mekanismer krever syntese av nye proteiner og omvandling av epitelceller involvert i transepitelial transport. Disse endringer forekommer i en tidsskala som vil tillate smolten å overlever i dens nye sjøvannsomgivelse. Jo mindre fisk, dess større er dens overflateareal/volum forhold. Således, mister mindre fisk sitt kroppsvann raskere og har mindre kroppsvannlagere til bufferendringer i kroppens ioniske sammensetning. Som et resultat, mister små fisk raskt vann og de kan ikke erstatte dette vannet ved drikking av sjøvann siden deres ioniske fjerningsmekanismer ikke er modne. Som et resultat, dør mindre eller non-mature smolt raskt av elektrolytt- og vann- ubalanser produsert av deres manglende evne til å tilpasse seg til den nye osmotiske og ioniske omgivelse av sjøvann. I motsetning, har større smolt som er større enn den "kritiske størrelse" et lavere overflateareal til volum-forhold, mister vann mindre raskt og har mer kroppsvann til buffer ioniske endringer. Denne større kroppsstørrelsen gir dem det nødvendige tidsintervall til å utvikle deres mer modne ioniske transportmekanismer som setter dem i stand til å overleve.I smolt som er enten mindre enn den kritiske størrelsen eller har umodne fysiologisk ionetransportmekanismer, produserer kombinasjonen av osmotisk fjerning av vann fra deres kropper koblet med inntak av ionerikt sjøvann spesifikke endringer i kroppsvæske og elektrolyttsammensetning. Disse endringer omfatter: en reduksjon i totalt kroppsvanninnhold, økninger i konsentrasjonene av kalsium, magnesium og natriumklorid. Abnormt høye konsentrasjoner av disse monovalente og divalente kationer forårsaker et vidt område av spesifikke endringer i organ og cellulære funksjoner omfattende endringer i cellulær metabolisme og nervekonduksjon, depresjon av normalt nervesystem og muskelaktivitet så vel som opphør av normalt inntak av mat og dens fordøyelse. Den unormale oppførselen til og klart uttrykk for meget stress før-døden fisk etter sjøvannsoverføring er faktisk noe som kan tilskrives de fysiologiske effekter av forhøyete ioner omfattende kalsium og magnesium innen kroppens fluider til fisken.Som beskrevet her, målinger av serum kalsium, magnesium og natrium bekrefter disse data så vel som demonstrerer at foreliggende oppfinnelse forårsaker en forandring i fysiologiske og ioniske transportmekanismer som tillater en vellykket sjøvannsoverføring av preadult anadrome fisk som er betydelig mindre enn den kritiske størrelsen som definert av dagens industri standardmetoder.Blod ble oppnådd fra fisk (laks og ørret) via venipunktur inn i den caudale sinus og forhindret fra koagulering ved tilsetning av litiumheparin. Blodet ble sentrifugert ved 4,000 rpm i 10 minutter og det resulterende serum oppsamlet og lagret inntil forsøk. Kalsium og magnesiumkonsentrasjoner av 2 mikroliter aliquoter av serum ble kvantifisert ved anvendelse av kalsium og magnesium forsøks testsett (Sett #595, #587 Sigma Aldrich, St Louis, MO ) og Na ble bestemt ved kommersiell testing (NorDx Laboratories, Skarborough, ME ) ved anvendelse av en Hitachi 747 analysemaskin.APS Prosess II etterligner eksponering for sjøvann uten tilstedeværelsen av en stor osmotisk gradient mellom fiskens kroppsvæsker og omgivende hypertoniske sjøvann.Figur 20 viser endringene i serum kalsiumkonsentrasjoner i ung ørret (gjennomsnitt kroppsvekt omtrent 30 gram) underkastet sjøvannsoverføring enten direkte fra ferskvann eller etter eksponering for forskjellige komponenter av APS Prosess II. Den gjennomsnittlige likevekts serum kalsiumkonsentrasjon i disse ørretene holdt i ferskvann er 2,72+/-0,16 mM. I motsetning, resulterer overføring av ørret til sjøvann i en betydelig økning i serum kalsium til omtrent 3,80 mM innen de innledende 24 timer etter sjøvannsoverføring. Denne økning i serum kalsium er forlenget for et intervall på omtrent 108 timer (4,5 dager) men senkes deretter til en litt lavere gjennomsnitts konsentrasjon på 3.20+/-0.42 mM ved 126 timer. Således, er indre PVCRs eksponert for en stigning i serum kalsium ved overføring av ferskvannsørret til sjøvann. Det akvatiske PVCRs ville faktisk føle og respondere til endringer i kalsium i dette konsentrasjonsområde. Således, utgjør økningen i serum kalsium (en PVCR agonist) sannsynlig et signal for initieringen av multiple PVCR-aktiverte prosesser i forskjellige organer for å tillate overlevelse av ung ørret i sjøvann.Plassering av ørret i vannblandingen ifølge foreliggende oppfinnelse som inneholder 3 mM kalsium og 1 mM magnesium og foring av ørreten med en standard ferskvannsdiett (Moore Clarke Feeds) resulterer i ubetydelige økninger i serum kalsium sammenlignet med serum kalsiumverdier for ørret holdt i ferskvann til tross for tilstedeværelsen av en netto innadrettet gradient av kalsium fra ytre vannblanding (3 mM) til indre kroppsvæsker (2,72 mM). Videre, er serum kalsiumkonsentrasjoner av ørret holdt i vannblandingen ikke endret ved endringer av den omgivende fotoperiode fra en normal (10 timer dagslys; 14 timer mørke) til kontinuerlig dagslyseksponering.Figur 21 viser økninger i serum kalsiumkonsentrasjoner fremkalt av foring av ørret holdt i vannblanding (3mM kalsium, 1mM magnesium) en standard ferskvann pelletert diett inneholdende ytterligere 1% natriumklorid (vekt/vekt). Foring med NaCI supplementert diett begynte umiddelbart etter bestemmelse av baselinje serum kalsiumkonsentrasjoner ved tid null. Noter at serum kalsiumkonsentrasjoner ble forhøyet etter et intervall på 24 timer. Datapunkter vist representerer totalt 5 eller flere uavhengige bestemmelser fra et enkelt representativt forsøk. Verdier ved 24 timer og 72 timer er betydelig (p<0,05) øket sammenlignet med verdien ved null tid.I motsetning, produserer foringen av ørret holdt i vannblandingen ifølge foreliggende oppfinnelse med et identisk standardfor, bortsett fra med tilsetning av 1% NaCI (vekt/vekt), en betydelig økning i serum kalsiumkonsentrasjoner innen 24 timer (Figur 21). Denne økning i serum kalsiumkonsentrasjoner av ørret etterligner stigningen produsert av overføring av ørret til sjøvann (sammenligne Figur 20 vs. 21). Denne effekten av dietær NaCI for å øke serum kalsiumnivåer forekommer sannsynlig fordi fisken er tvunget til å eskretere dette overskudd av NaCI som den har inntatt. Inntak av dette overskudd av NaCI aktiverer fiskens drikkeoppførsel som derved forårsaker den til inntak av vannblanding inneholdende 3 mM kalsium og derved øker dens kroppsvæske kalsiuminnhold via tarmabsorpsjon av kalsium. Inntak av 1% NaCI alene endrer ikke serum kalsiumkonsentrasjoner. Således, ble serum kalsiumkonsentrasjon til ørret holdt i ferskvann (2,72+/- 0,43 n=6) ikke endret betydelig etter konsum av for inneholdende 1% NaCI (vekt/vekt) for så lenge som 30 dager (2,37+/-0,25 n=5). Disse data gir en demonstrasjon av at denne protokollen er nødvendig for å oppnå økning av serum kalsiumkonsentrasjoner i anadrome fisk. Overføring av større atlantisk laksesmolt oppvokst i ferskvann som har industristandard "kritisk størrelse" til sjøvann øker sine serum kalsium og natriumkonsentrasjoner: Dataene vist i Figur 20 viser at den gjennomsnittlige serum kalsiumkonsentrasjon øker med omtrent 40% når ørret blir overført fra ferskvann til sjøvann. Størrelsen av denne økningen er forbundet med betydelig ørretdødelighet (omtrent 30-40%) på grunn av osmoregulerende svikt i disse fiskene som er mindre enn den "kritiske størrelse" for ørret. I motsetning, er størrelsen av økninger i serum kalsiumkonsentrasjoner mindre (omtrent 30% økning) når større atlantisk laks smolt som har den kritiske størrelse 60-70 gram blir overført til sjøvann (Figur 22A-B). I dette samme intervall etter sjøvannsoverføring, øker serum natriumkonsentrasjoner i disse samme fisk med omtrent 17%. Data avledet fra både ørret (Figur 21) og laks (Figur 22A-B) ble bare oppsamlet fra fisk som ikke viste noe synlig tegn på stress (dvs. stresset fisk viser kropps diskolorasjon, bisarr svømmeoppførsel eller markert redusert aktivitetsnivåer) under dette forsøket. Figur 22 viser endringer i serum kalsium (Figur 22A) og natrium (Figur 22B) etter sjøvannsoverføring av S1 atlantisk laks smolt som har den kritiske størrelse som definert ved standard i dagens praksis. Hvert datapunkt representerer gjennomsnitt +/- SD av 5-10 uavhengig målinger. Figurer 23A-B viser post sjøvannsoverførings verdier for serum kalsium, magnesium og natrium oppnådd fra en kohort av 80 S1 atlantisk laks smolt identisk med den vist i Figur 22 etter totalt 45 dager av behandling med APS Prosess I (3mM Ca2+, 1 mM Mg2+ i vann) og 7% NaCI kosttilskudd i mat. Bemerk at det innledende serum kalsium i fisk eksponert for APS Prosess I er litt større (2,5 vs 3,0 mM) og endringer i serumkonsentrasjoner av kalsium og natrium er lignende de vist i Figur 22. Videre, gjennomgår ikke kalsium og magnesium dramatiske økninger i det innledende 120 timer intervallet som disse fiskene blir overført fra kalsium/magnesium vannblanding til sjøvann. I motsetning, øker serum natriumkonsentrasjonen omtrent 12% (178,8 mM fra 158,0mM) innen de første 24 timer.Tilsammen, demonstrerer disse data vist i Figurer 19-23 at økning i både serum kalsium og natrium forekommer etter overføring av preadult anadrome fisk fra ferskvann til sjøvann. Videre, er den totale ekspresjon av PVCR protein modulert i spesifikke celler involvert i denne osmoregulerende respons så som intestin. Siden PVCRs kan respondere til endringer av både kalsium og natrium innen disse konsentrasjonsområdene, indikerer disse data at et nytt "sett-punkt" for PVCR aktivitet er etablert etter overføring av fisk til sjøvann.Dataene vist i Figurer 21-23 demonstrerer at behandling av preadult anadrome fisk med APS Prosess I forårsaker økninger i serum kalsiumkonsentrasjonene av fisken som etterligner dem produsert av deres overføring fra ferskvann til sjøvann. Eksponering av fisken til kombinasjonen av kalsium og magnesium i vannet og NaCI i foret forårsaker øket kalsium inntak som gjenspeiler drikking av hypertonisk sjøvann uten det ledsagende osmotiske stress. Således, er PVCRs i APS Prosess I fisken eksponert for kalsium og magnesium og, som et resultat, er fisken lettere i stand til å adaptere til sjøvann når den er etterfølgende overført til det.Anadrome fisk som har synlige symptomer på stress etter overføring til sjøvann har forhøyede serumverdier av kalsium og/eller magnesium. Den manglende evne til fisk til å utskille disse ioner er hovedårsaken til deres død etter sjøvannsoverføring: Når før-voksen anadrome fisk blir overført til sjøvann enten direkte fra ferskvann eller etter eksponering for the APS Prosess I, er en del av det totale antall av fisk ofte ute av stand til til adaptere til de dramatiske forskjeller i osmolalitet og ionisk sammensetning mellom ferskvann og sjøvann og dør av resulterende elektrolytt-ubalanser. Observasjoner som omfatter oppsporing av fisk som til slutt vil utånde innen kort tids intervall (24-120 timer) etter sjøvannsoverføring demonstrerer at de begynner å vise synlige tegn på høye nivåer av stress omfattende endringer i deres normale lett sølv- kroppsfarge til en mørkere mattere lød så vel som å utvise bisarr svømmeoppførsel eller markert redusert aktivitetsnivåer 24-72 timer før sin død.Sammenligning av serum kalsium, magnesium og natriumkonsentrasjoner fra kontroll u-stresset fisk vs fisk som har tegn på høye nivåer av stress viser at serum ionekonsentrasjoner i stresset fisk er betydelig høyere sammenlignet med kontroll (Tabell 12).Disse tegn på høyt stress er direkte refererbare til abnormt forhøyede konsentrasjoner av kalsium, magnesium og natriumioner innen kroppsfluider av fisken. Således, dør pre-adult anadrome fisk som er ute av stand til å eskretere overskudd av divalente kationer så vel som prosessere sjøvann til å erstatte kroppsvann som er mistet via osmose fra konsekvensene av elektrolytt-ubalanser. Anadrome fisk under den kritiske størrelse er ikke i stand til å raskt adaptere til den nye osmotiske omgivelsen av sjøvann og dør som et resultat.Eksponering av pre-adult atlantisk laks fisk under den "kritiske størrelse" som definert ved dagens industri standardmetoder til APS Prosess II forhindrer de dødelige forhøyelser av serum kalsium, magnesium og natrium og tillater således vellykket sjøvannsoverføring av fisk som har meget små kroppsvekter: Før-voksen atlantisk laks av St John/St John stammen ble begynt på APS Prosess II omfattende en vannblanding (3mM Ca2+ og 1 mM Mg2+) så vel som foret en kombinasjon av 7% NaCI og 2 gm/kg (vekt/vekt) L-Tryptofan(APS Prosess II) totalt 49 dager mens de ble utsatt for en kontinuerlig fotoperiode. Disse små, men behandlede pre-voksne atlantiske laks (betegnet APS Prosess II smolt) ble deretter plassert i sjøvann i enten et enkelt havgarn (netpen) eller i laboratorietanker (15,6°C) innen forskningsfasilitetene. Figur 24 sammenligner kroppskarakteristika av APS Prosess II smolt som med hell adapterte til sjøvann vs APS Prosess II smolt fra samme gruppe som var ute av stand til å tilpasse seg til sjøvann og døde.Som vist i Figur 24, opplevde bare de atlantisk laks pre-voksne fisk behandlet med APS Prosess II med de minste kroppsvektene (omtrent 10%) post sjøvann mortalitet etter 5 dager i laboratorietanker. Sammenligning av gjennomsnittlig kroppsstørrelse av 90% overlevende APS Prosess II smolt vs. de 10% APS Prosess II smolt som døde viser at ikke-velykkede APS Prosess II smolt har mindre kroppsvekter (5,10+/-2,2 gm) sammenlignet med gjennomsnittlig kroppsstørrelse av hele APS Prosess II overføringgruppe (11,5+/-5,65 gm). Således, er den kritiske størrelse for disse APS Prosess II smolt omtrent 13 gm. Denne kritiske kroppsstørrelsen er bare 13-18,6%(13/70-100) den av den kritiske størrelse definert tidligere av industri standardteknikker. Således, viser disse data at anvendelse av fremgangsmåten II har redusert den "kritiske størrelse" av atlantisk laks parr/smolt med over 80%.Kvantifisering av serum kalsium, magnesium og natriumkonsentrasjoner i APS Prosess II smolt som med hell har gjort overføringen fra kalsium/magnesium vannblanding til sjøvann er vist i Figur 25. Det er verd å merke seg at serumkonsentrasjoner av kalsium, magnesium eller natrium ikke forandret seg til tross for det faktum at den gjennomsnittlige kroppsstørrelse av disse APS Prosess II smolt er mindre enn 20% (11,5/60,5 gm ) av den normale "kritiske størrelse" for atlantisk laks smolt produsert ved anvendelse av dagens industri standardmetoder. Figur 25 viser at verken serum kalsium, magnesium eller natriumkonsentrasjoner øker dramatisk hvilket ville være forventet fra data vist i Figur 20 og Tabell 2 så vel som data publisert tidligere. Behandling av industristandard atlantisk laks smolt/parr med APS Prosess II resulterer ikke i dramatiske økninger i konsentrasjonene av noen som helst ioner målt ovenfor, til tross for den betydelig mindre kroppsstørrelsen av APS Prosess II smolt, sammenlignet med storindustri standardsmolt. Sammenligning av data vist i Figurer 22A-B (Industristandard S1 smolt), Figur 23 (Industristandard S1 smolt behandlet med APS Prosess I vs Figur 25 (pre-adult laks mindre enn 20% av industristandard kritisk størrelse) avslører også at disse serumkonsentrasjoner for de mindre APS Prosess II smolt er sammenlignbare med dem vist med de større industristandard S1 smolt. I oppsummering, viser disse data at pre-adult atlantisk laks behandlet med APS Prosess II ikke viser dramatiske endringer i sin kroppssammensetning av kalsium, magnesium og natrium til tross for sin betydelig mindre størrelse. Denne mangel på endringer i konsentrasjonene av disse ioner reduserer sterkt stress i disse fiskene og tillater dem å tilpasse seg lett til sjøvann.Det er to generelle metoder for å fremstille for for konsum av fisk som del av APS Prosess I og II. Disse to prosesser involverer enten reformuerling av for eller tilsetning av en konsentrasjonsløsning for absorpsjon av foret fulgt av en topp dressing for palatabilitet. Denne beskrivelsen beskriver metodologien for å fremstille for ved anvendelse av hver av disse 2 metoder.For å reformulere for, er bestanddelene som følger: Base Diett ble utført ved anvendelse av de følgende bestanddeler og prosedyre: 30% Squid (flytendegjort i blandemaskin), 70% Corey Aquafeeds flyndrediett (pulverisert i blandemaskin). Bestanddeler ble blandet til en halvfuktig "dough" ball. Andre bestanddeler omfattende NaCI eller PVCR aktive forbindelser ble blandet til basisdiett etter vekt i henhold til hva forsøket krevet.Moore Clark standard ferskvann laksefiskdiett (størrelser 1,2,1,5, 2,0, 2,5 og 3,5 mm) kan også anvendes. En toppdressing ble påført på pelletene slik at toppdressing er sammensatt av 4% av vekten til basisdietten. Toppdressingen er sammensatt av 50% krillhydrolysat (Specialty Marine Products Ltd.) og 50% Menhaden fiskeolje. Toppdressingen blir tilsatt for palatabilitet og forsegling av tilsatte bestanddeler.Andre bestanddeler kan omfatte NaCI, MgCb, CaCfe eller L-Tryptofan som blir tilsatt etter vekt til basisdiett etter vekt.For APS Prosess I: Fast natriumklorid eller NaCI porsjonert ved et forhold på 7% av vekten til Moore Clark standard ferskvann salmonid-diett-vekt ble satt til et volum på springvann omtrent 3-4 ganger vekten til NaCI. Blandingen ble oppvarmet til 60-70°C med blanding via anvendelse av en magnetisk omrøringsanordning for å oppløse salt. NaCI- løsningen ble deretter hellet i en håndholdt sprayer og påført på Moore Clark standard ferskvann salmonid-diett som tumles inne i en 1,5 kubisk meter motorisert-sementblander. Etter absorpsjon av den NaCI-rike løsningen, ble den fuktede Moore Clark standard ferskvann salmonid- dietten spredt ut tynt på "vindu screening" og plassert i et lukket hyllesystem utstyrt med en vifte og 1500 watt oppvarmer for å påskynde tørkeprosessen. Etter tørking i omtrent 6 timer, ble tørkede NaCI-rike pellets returnert til sementblanderen og en toppdressing ble påført. Foret blir lagret ved romtemperatur inntil anvendelse.Fremstilling av for inneholdende 7% (vekt/vekt) NaCI + PVCR agonist (tryptofan) for APS Prosess II: Fast natriumklorid eller NaCI porsjonert i et forhold på 7% av vekten til Moore Clark standard ferskvann salmonid-diett-vekt ble satt til et volum på springvann omtrent 3-4 ganger vekten til NaCI. Blandingen ble oppvarmet til 60-70° C med blanding via anvendelse av en magnetisk omrøringsanordning for å oppløse salt. USP Grade L-Tryptofan ble satt til vannet ved enten 2 gram eller 4 gram for hver kg av Moore Clark standard ferskvann salmonid-diett avhengig av sammensetning påkrevet. Fortynnet saltsyre ble satt til vannet med blanding inntil tryptofanet ble oppløst og pH i løsning ble omtrent 4,0. NaCI + tryptofan-løsningen ble deretter hellet i en håndholdt sprayer og ble deretter påført på Moore Clark standard ferskvann salmonid-dietten tumlet inne i en sementblander. Etter absorpsjon av NaCI+tryptofan-løsningen, ble den fuktede Moore Clark standard ferskvann salmonid-dietten deretter spredt ut tynt på "vindu screening" og plassert i et lukket rack- system utstyrt med en vifte og 1500-watt ovn for å fremskynde tørkeprosessen. Etter tørking i omtrent 6 timer, ble de tørkede NaCI/Tryptofan-rike pellets deretter returnert til sementblanderen og en toppdressing påføres. Foret blir lagret ved romtemperatur inntil anvendelse. L-Tryptofan kan erstattes med hvilken som helst aminosyre, beskrevet her, som modulerer PVCR ekspresjon.Eksempel 9: DNA og antatte proteinsekvenser fra partiell genomiske kloner av polyvalente kation reseptorproteiner amplifisert med PCR fra DNA av 8 arter av anadrome fisk.Disse data gir de partielle genomiske sekvenser avledet fra PVCR genet i 8 arter av anadrome fisk. En full-lengde klon ble isolert som beskrevet i Eksempel 1. Hver av disse nukleotidsekvenser er unike og således kunne anvendes som en unik probe for å isolere full-lengde cDNA fra hver art. Videre, kunne dette DNA-fragmentet danne basis for et spesifikt forsøks testsett for deteksjon av PVCR ekspresjon i forskjellige vev av disse fisk. Se Eksempel 19.PVCR er isolert i mange arter av laks, røye og ørret. Sekvenser av pattedyr-CaRs sammen med nukleotidsekvensen av SKCaR (Figurer 28A-E) ble anvendt til å designe degenererte oligonukleotidprimere til meget konserverte regioner i transmembrandomenet av polyvalent kation reseptorproteiner ved anvendelse av standardmetoder (Se GM Preston, Polymerase chain reaction with degenerate oligonucleotide primers to done gene family members, Methods in Mol. Biol. Vol. 58 Edited by A. Harwood, Humana Press, pages 303-312,1993). Ved anvendelse av disse primere, cDNA eller genomisk DNA fra forskjellige fiskearter representerende viktige kommersielle produkter er amplifisert ved anvendelse av standard PCR metodikk. Amplifiserte bånd blir deretter renset ved agarosegel elektroforese og ligert inn i passende plasmidvektor som blir omdannet til en bakteriell stamme. Etter vekst i flytende medier, blir vektorer og innskudd renset ved anvendelse av standardteknikker, analysert ved restriksjonsenzym analyse og sekvensert hvor passende. Ved anvendelse av denne metodologien, ble nukleotidsekvenser amplifisert.For å danne dataene vist i Figurer 26 og 27, ble DNA isolert fra muskelprøver fra hver av de angitte artene ved anvendelse av standard publiserte teknikker. DNA ble deretter amplifisert ved anvendelse av polymerasekjedereaksjon (PCR) metodikk omfattende 2 degenererte PCR primere (DSK-F3 og DSK-R4; SEKV ID NR:22 og 23). Amplifiserte DNAs ble deretter renset ved agarosegel elektroforese, subklonet inn i plasmidvektorer, amplifisert, renset og sekvensert ved anvendelse av standardmetoder. Figur 26 viser en oppstilling av genomiske DNA-sekvenser på 594 nukleotider i 8 anadrome fiskearter som hver koder for en identisk region av PVCR proteinet. Legg merke til at hver nukleotidsekvens avledet fra hver spesifikk art er unik. Imidlertid, forekommer endringer i DNA-sekvensene av disse genene ofte ved felles spesifikke nukleotider innen hver sekvens på 594 nukleotider. Figur 27 viser oppstilt tilsvarende forutsagte proteinsekvenser avledet fra genomiske nukleotidsekvenser vist i Figur 26. Noter at bare 3 endringer i aminosyresekvensen av denne delen av PVCR forekommer som en konsekvens av endringer i nukleotidsekvensen som vist i Figur 26. Alle disse endringer (Ala til Val; Arg til Lys; og Cys til Tyr) er kjent som "konservative" substitusjoner av aminosyrer i at de konserverer noe kombinasjon av den relative størrelse, ladning og hydrofobisitet av peptidsekvensen.Eksempel 10: Effekten av kontinuerlig fotoperiode for å redusere mortaliteten av smolt som mottar APS Prosess II behandling.Dataene viser betydelig forbedring i post sjøvannsoverføring mortaliteter når APS Prosess II fisk er eksponert for en kontinuerlig fotoperiode heller enn en diskontinuerlig fotoperiode sammensatt av 10 timer av lys og 14 timer av mørke.Beskrivelse av eksperimentell protokoll: Tre eksperimentelle grupper av 100 fisk ble tatt fra en enkel gruppe med 1 200 St. John/St John APS Prosess II fisk (gjennomsnittlig vekt på 11,5 gm) som hadde vært underkastet totalt 45 dager av APS Prosess II omfattende en diett supplementert med 7% NaCI og tryptofan. Under dette 45 dagers intervallet med behandling med APS Prosess II i ferskvann, ble disse fiskene eksponert for en kontinuerlig fotoperiode av lys. For å initiere forsøket hvor virkningene av å kontinuere denne konstante fotoperioden etter sjøvannsoverføring ble testet, hver gruppe med 100 fisk ble plassert i individuell 1 meter sirkulære tanker inneholdende sjøvann (32 ppt) som ble utstyrt med sitt egne biofilter og holdt ved en konstant 19 °C. For å opprettholde optimal vannkvalitet, ble parametere kontrollert daglig og varierte ikke mellom noen av de 3 eksperimentelle tankene. Tank #1 (kontinuerlig) ble eksponert i en kontinuerlig fotoperiode ved anvendelse av en standard fluorescerende kolbe lokalisert 1 meter fra overflaten av tanken inneholdende sjøvann. Tank #2 og #3 også fylt med sjøvann (diskontinuerlig #1 og #2) ble eksponert for en diskontinuerlig fotoperiode bestående av identiske lysbetingelser med Tank #1 for et daglig intervall på 10 timer fulgt av 14 timer av fullstendig mørke produsert av å dekke tankene #2 og #3 med et lystett tung polyetylenplastikk-dekke. Dette lys-mørk regime er lignende den som oppleves av APS Prosess II fisk når plassert i havgarn under diurale betingelser tilstede i sommer/tidlig høst på den nordlige hemisfære. Mortaliteter som forekommer i hver av de 3 tankene ble kontrollert 3 ganger pr. dag og hvilken som helst døde fisk fjernet umiddelbart. Fisk ble tilbudt standard fuktig diett begynnende på Dag #3.Resultater: Figur 29 og Tabell 13 viser antallet mortaliteter som skjedde ved eksponering av APS Prosess II fisk til enten en kontinuerlig vs. diskontinuerlig fotoperiode etter overføring til full styrke sjøvann. Mortalitetene av APS Prosess II fisk var lav (6%) under det innledende 96 timers intervallet etter sjøvannsoverføring når disse ble eksponert for en kontinuerlig fotoperiode. I motsetning, begge grupper av APS Prosess II fisk som ble eksponert for en diskontinuerlig fotoperiode (10 timer kontinuerlig lys fulgt av 14 timer mørke) opplevde dødligheter som var 4,8 ganger (29%) og 6,5 ganger (39%) høyere sammenlignet med APS Prosess II fisk eksponert for en kontinuerlig fotoperiode. Disse data viser at eksponering av APS Prosess II fisk for en kontinuerlig fotoperiode under de innledende 4 dager etter sjøvannsoverføring betydelig reduserer deres dødelighet. Disse data gir en enkel forklaring på de differensielle dødligheter observert når disse APS Prosess II fisk blir overført til sjøvannstanker i APS laboratoriet (som har en kontinuerlig fotoperiode) vs. havgarn (som har en naturlig fotoperiode med intervall av mørke). Data inneholdt i Tabell 7 viser også at eksponering av 15 gm og større ung laks behandlet med APS Prosess II opplevde lave (0,2%) mortaliteter etter sjøvannsoverføring i havgarn inneholdende undervannslys som illuminerer fisk i 30 dager.Eksempel 11: Veksthastigheter av ung atlantisk laks for APS Prosess II.Laboratoriedata av dette forsøket viser at ung atlantisk laks som blir holdt i ferskvann har samme vekstrate som de fiskene som er eksponert for APS Prosess II før overføring til sjøvann.Beskrivelse av eksperimentell protokoll: Dette forsøket ble utformet for å sammenligne veksthastighetene av ung atlantisk laks som gjennomgår APSProsess II til matchede kontroller som ble opprettholdt i ferskvann (FW). Totalt 187 kontroll og 314 eksperimentell St John/St John ung atlantisk laks ble valgt tilfeldig fra en stor pool av fisk avledet fra en enkelt klekking. Begge grupper ble holdt på isokaloriske dietter og eksponert for vann med identisk vannkvalitets karakteristika såvel som temperaturer. Imidlertid, ble den eksperimentelle gruppen med fisk underkastet APS Prosess II i totalt 6 uker (45 dager). Lengdene og vektene av individuelle fisk fra begge grupper ble deretter målt og deres fordelinger sammenlignet som vist i Figur 30.Resultater: I dette forsøket, viser disse data at begge grupper oppnådde identiske vekstrater. Det var ingen betydelige forskjeller mellom gjennomsnittlige kroppsvekter (26+/-9,5 APS Prosess ll-fisk vs 23+/-7,7 gm kontroll FW p=0,30) eller gjennomsnittlige kroppslengder (13.2+/-1,7 APS Prosess ll-fisk vs 13.3+/-1,5 cm kontroll FW p=0,43) i de to grupper. Det var ingen mortaliteter i noen av gruppene med fisk under varigheten av forsøket. Således, resulterte i dette henseende, APS Prosess II ikke i hverken økede eller reduserte veksthastigheter av ung atlantisk laks under ferskvannsfasen, sammenlignet med standard ferskvannspraksiser.Eksempel 12: Ytterligere vekstdata for APS Prosess II fisk i sjøvann laboratorietanker.Veksthastigheter og for -omdannelsesforhold av APS Prosess II fisk demonstrerer verdien av APS Prosess II. Disse data gir spesifikk informasjon som resultatet av ung atlantisk laks av forskjellige størrelser i området fra <5 gm til omtrent 30 gm etter deres eksponering for APS Prosess II i ferskvann og deretter overføring til sjøvann. Gjentatte målinger av hver enkelt gruppe med APS Prosess II fisk over et 157-dagers intervall gir en omfattende evaluering av vekstytelse, dødelighet og for-utnyttelse under dette intervallet. Mortalitetsdata demonstrerer at APS Prosess II fisk som veier mer enn 15 gm ved tiden for deres sjøvannsoverføring vokser raskt, opplever ingen dødelighet og anvender for meget effektivt, sammenlignet med dagens industristandard atlantisk laks smolts (60-120 gm) som veier 4 ganger mer enn APS Prosess II fisk. I motsetning, gjør APS Prosess II fisk som har kroppsvekter på mindre enn 15 gm ved tiden for sjøvannsoverføring det dårlig og enten dør av akutt osmoregulerende svikt eller lider osmotisk skade og blir "slinks eller pinheads" som har karakteristika lignende dem utvist av en subpopulasjon av meget større av dagens industristandard smolt. Disse siste observasjoner definerer den lavere grense av effektivitet av foreliggende APS Prosess II som påført på ung atlantisk laks.Beskrivelse av eksperimentell protokoll: Utformingen av dette forsøket er beskrevet i Eksempel 2. I Eksempel 2, ble data oppnådd i et 21-dagers intervall etter sjøvannsoverføring. I dette eksemplet, ble mortalitetene, SGR, temperaturkorrigert SGR (GF3), FCR, kroppsvekter, lengder og betingelsesfaktorer for disse samme fiskene oppnådd en total av 4 ytterligere intervaller under et intervall som nå varer i 157 dager. Etter eksponering for APS II prosess og overføring til sjøvann, ble vekst av laksen målt ved gjentatte målinger av lengde og vekt over et 157 dagers intervall.Resultater: Tabell 14 tilveiebringer en oppsummering av data for denne gruppen med APS Prosess II fisk etter deres overføring og vekst i laboratorie sjøvannstanker i et intervall på 157 dager. Bemerk at de første intervall av Tabell 14 svarer til dataene vist i Tabell 10, i kolonnen merket "APS Prosess II" med 2 dataverdier som krever justeringer for eksperimentelle data rapporterende konsistens. Den første justering gjelder tabuleringen av antall dager i sjøvanns entre. Den opprinnelige entre angitt 21, mens de nye data i Tabell 14 viser 20 dager. Denne forskjellen er fordi den opprinnelige entre omfattet dagen som fisken faktisk ble overført til sjøvann. Siden denne verdien representerer bare et 12 timers intervall, har det vært korrigert til verdien av 20 dager. Som et resultat av dette faktum, er en mindre justering av den innledende SGR verdi fra 0,68 (Tabell 10 opprinnelig) til 0,725 (Tabell 14) nødvendig. Den andre justeringen angår den opprinnelige FCR verdi på 2,04 når fisken ble matet fuktig for inneholdende 30% vanninnhold under deres innledende 20-dagers intervall i sjøvann. Siden APS Prosess II fisk ble matet fuktig for i totalt 60 dager og deretter omdannet til tørrfor (9% fuktighetsinnhold) rapporterer Tabell 14 nå en SGR verdi på 1,43 istedenfor 2,04 reflekterende en korreksjon for SGR av det intervallet på en korrigert tørrvekt-for basis. Disse SGR og GF3 korreksjoner for 30% fuktighetsinnhold er gitt som fotnoter til Tabell 14. Dataene oppsummert i Tabell 14 viser at den totale dødelighet av APS Prosess II fisk som veier 15 gm eller mer ved tiden for sjøvannsplassering var 1,1% for hele 157 dagers intervallet. Denne dødelighetshastigheten er meget lav og innen de forventede grenser av normalt fiskeoppdrett til tross for omhyggelig pleie. I motsetning, var det totalt 231 mortaliteter eller 54,2% av det totale antall av APS Prosess II fisk overført til sjøvann i den subpopulasjonen som veier mindre enn 15 gm ved sjøvannsoverføring. Alle disse mortaliteter skjedde i 2 "bølger" innen de første 60 dager etter sjøvannsoverføringen. De første skjedde innen 20 dager av sjøvannsplasseringen og var forårsaket av akutt osmoregulerende svikt. Alle disse fisk var mindre enn 13 gm i kroppsvekt. Den andre gruppen med 138 fisk døde innen det påfølgende 40-dagers intervallet og utgjorde 31% av totalen. Figur 31 sammenligner kroppskarakteristika av disse 138 mortaliteter med lengder og vekter av APS Prosess II fisk ved tiden for sjøvannsoverføring. Det er bemerkelsesverdig at et betydelig antall av disse fiskene viste betydelige reduksjoner i kroppsvekt (vist i Figur 31 som fylte triangler som er forskjøvet mot høyre sammenlignet med deres respektive størrelser etter sjøvannsplassering) og fått utseende av osmotisk skadet fisk som er betegnet "slinks eller pinheads" som skjedde regelmessig i større (60-100 gm) atlantisk laks smolt. Således, definerer disse data den lavere grensen for kroppsstørrelse for vellykket overføring av APS Prosess II fisk til sjøvann ved 15 gm kroppsvekt og mer.Tabell 14 og Figur 32 viser SGR og GF3 verdier for overlevende APS Prosess II fisk i det 157-dagers intervallet hvor totalt 5 uavhengig målinger ble registrert. Under dette intervallet, øket APS Prosess II fisk raskt sin kroppsvektsstørre mer enn 9 ganger (15,2 gm til 142,5 gm). Initiert, viste APS Prosess II fisk bare beskjedne SGR/GF3 verdier for de første 20-dagers intervall etter sjøvannsoverføring. Imidlertid, ble deres veksthastigheter deretter doblet for hver av de 2 suksessive intervallene med en topp av SGR 2.87/GF3 2,33 som skjedde mellom 60-82 dager etter sjøvannsoverføring. Under dette intervallet vokste fisken fra 31,5 gm til 59,3 gm kroppsvekt. Deretter, avtok SGR/GF3 verdiene under deFCR verdiene for 60 dagers intervallet umiddelbart etter sjøvannsoverføring midlet 1,37 når APS Prosess II fisk ble matet fuktig for inneholdende 30% vanninnhold som vist i Tabell 14 og Figur 32. FCR verdier avtok deretter til gjennomsnittlig 0,77 for de gjenværende 97 dager når fisk ble matet tørrfor inneholdende mindre enn 9% vanninnhold. Disse lave FCR verdier sammenlignes fordelaktig med dagens industristandard FCR-verdier av større atlantisk laks smolt som har gjennomsnitt 0,9-1,4.Figur 33 viser de progressive økninger i kroppsstørrelse og lengde under de siste 3 måleintervaller. Noter at den største fisken er omtrent 300 gm, som representerer en minimumsvekst på over 10 ganger kroppsvekt ved sjøvannsoverføring. Alle fiskene har en utmerket kondisjonsfaktor (k) som har lagt på seg kroppsvekt i passende proporsjon til lineær vekst.Eksempel 13: Sammenligning av spesifikke veksthastigheter (SGRs), for-omdannelses forhold (FCR), daglig forkonsumhastigheter og kroppskarakteristika av paret ung atlantisk laks som veier enten 20 gm eller 40 gm under et 61 dagers intervall hvor grupper ble holdt i enten ferskvann eller behandlet med APS Prosess II og overført til sjøvann.Forsøkene beskrevet her sammenlignet vekstytelse av ung atlantisk laks som enten ble: 1) behandlet med APS Prosess II og overført til sjøvann eller 2) holdt i ferskvann. Disse forsøkene sammenlignet også vekstytelsen av mindre (20 gm) vs. større (40 gm) APS Prosess II fisk etter deres overføring til sjøvann og sammenlignet disse data til de oppnådd på matchede ferskvannskontroller. Den totale konklusjon fra dette 61 dagers forsøket er at både 20 gram og 40 gram ung atlantisk laks med hell kan overføres til sjøvann. I motsetning til hva som ville bli forutsagt av dagens industristandarder hvor den mindre 20 gram fisken ville lide av et dårligere resultat, sammenlignet med den større 40 gram fisken og hvor begge ville yte i en betydelig underlegen grad sammenlignet med større 80-100 gm standardfisk, disse data beskrevet nedenfor viser at 20 gram fisk ytet sammenlignbart med begge 40 gram fisk. Disse data gir ytterligere bevis for at både 20 gram og 40 gram fisk kan overføres tii sjøvann etter behandling med APS Prosess II, til tross for det faktum at deres kroppsstørrelser er omtrent 1/5 og 2/5 av den kritiske størrelsen som definert av dagens industristandard metoder. Disse data viser også at både 20 gm og 40 gm APS Prosess II fisk oppnår SGRs, FCRs og vekst i kroppskarakteristika likt eller bedre enn konvensjonell større industristandard smolt etter sjøvannsoverføring. Som målt ved SGR og FCR kriterier, utmanøvrerte 20 gm APS Prosess II fisk den større 40 gm APS Prosess II gruppen. Imidlertid, viser både 20 gm og 40 gm APS Prosess II fisk initielt underlegne SGRs, FCRs og kroppsvekter sammenlignet med matchede kontroller som forblir i ferskvann. Denne temporære reduksjon i ytelse er bare under de innledende intervallene av deres adapsjon til sjøvann. Bemerk, disse APS Prosess II fisk oppnå markerte forbedringer i SGR, FCR og kroppsvekter umiddelbart følgende dette 61 dagers intervallet som gir en ekstremt rask vekst i sjøvann som vist i Eksempel 12.1. Både 20 gm og 40 gm APS Prosess II fisk ble overført til sjøvann og matet bare 4 dager med fuktig for (30% fuktighetsinnhold) og deretter matet tørrfor (<9% vanninnhold) i resten av forsøket. Disse dataene demonstrerer ytterligere verdien av APS Prosess II siden normalt dagens industristandard fisk i nordøstlig del av Nord-Amerika blir matet fuktig for i omtrent 14-30 dager. 2. Gjennomsnittlig 61 dagers SGRs i 20 gm og 40 gm APS Prosess II fisk etter deres overføring til sjøvann var 65% og 57% av SGR verdier oppnådd med matchede kontroller som henholdsvis forble i ferskvann. APS Prosess II fisk som veier 20 gm ved tiden for sjøvannsoverføring viste at større gjennomsnittlig SGR sammenlignet med deres større 40 gm motparter. 3. SGRs oppnådd med 20 gm og 40 gm APS Prosess II fisk øket med henholdvis 58% og 36% under det andre 30-dagers intervallet sammenlignet med det første 30-dagers intervallet reflekterende tilpasning til den nye sjøvannomgivelse. 4. Som resultatet av deres lavere SGRs, var den gjennomsnittlige endelige kroppsvekt oppnådd med 20 gm APS Prosess II fisken etter sjøvannsoverføring 73,4% av verdien oppnådd av deres matchede ferskvannskontroller. Tilsvarende, var den gjennomsnittlige endelige kroppsvekt oppnådd med større APS Prosess II fisk 71,0% verdien av deres matchede kontroller. Disse data viser at mindre APS Prosess II fisk viste en lignende grad av vekst, sammenlignet med deres større 40 gm motparter. 5. Gjennomsnittlig FCR av mindre 20 gm APS Prosess II fisk var sammenlignbar med den vist av den større 40 gm APS Prosess II fisk under hele 60 dagers intervallet etter sjøvannsoverføring. 6. Både 20 gm og 40 gm APS Prosess II fisk spiste umiddelbart når tilbudt mat 48 timer etter sjøvannsoverføring. Imidlertid, viste begge størrelser av APS Prosess II fisk et intervall på omtrent 25-30 dager av undertrykket spising etter deres sjøvannsoverføring sammenlignet med matchede ferskvannskontroller. Denne reduksjonen i APS Prosess II daglig forkonsum ble deretter utjevnet med den til ferskvannskontroller for det gjenværende 30-35 dagers testintervallet.Beskrivelse av eksperimentell protokoll: Disse seriene av forsøk ble utformet for å teste hvorvidt mindre (20 gm kroppsvekt) ung atlantisk laks viser skadelige effekter fra plassering i sjøvann (SW) etter APS Prosess II sammenlignet med enten kontrollfisk av identisk størrelse holdt i ferskvann (FW) eller større ung atlantisk laks (40 gm) som ble enten holdt i ferskvann eller overført til sjøvann på en måte identisk med deres mindre 20 gm motparter. Å kvantifisere en hvilken som helst endring i vekst og for-utnyttelse, en kombinasjon av veksthastigheter, FCR, daglig matkonsum så vel som kroppsvekter, lengder og betingelsesfaktorer ble målt for hver gruppe. Alle de 4 grupper som ble studert ble avledet fra en enkelt klekking av St. John/St. John fisk og ble behandlet som følger: 1. Medium størrelse 40 gm kontrollfisk holdt i FW i et 103-dagers intervall og matet standard tørrfor bortsett fra for de 4 dagene da deres APS Prosess II motparter mottok fuktig for og de mottok identiske forpreparater. For deres siste 61 dager i FW, SGR, FCR og daglig matkonsum ble målt (n=84). 2. Små størrelse 20 gm kontrollfisk holdt i FW for 103 intervallet på en måte identisk med den beskrevet i #1 for deres 40 gm motparter (n=51). 3. Medium størrelse 40 gm APS Prosess II fisk eksponert for APS Prosess II for et intervall på 42 dager deretter overført til sjøvann matet fuktig for i 4 dager og deretter switchet til tørrfor og holdt i 61 dager (n=99). 4. Små størrelse 20 gm APS Prosess II fisk eksponert for APS Prosess II for et intervall på 42 dager deretter overført til sjøvann, matet fuktig for i 4 dager og deretter switchet til tørrfor og holdt i 61 dager (n=80).Hver gruppe med fisk ble holdt i individuelle 1 -meter sirkulære tanker med tilsvarende biofilter for å sikre at vannkvalitet ble holdt ved identisk høye standarder og således ikke bidro til variabilitet innet forsøket. Alle fiskene ble matet identiske matrasjoner med unntak av APS Prosess II fisk under 42 dagers APS Prosess II selv, hvor mat inneholdt 7% NaCI og 2 gm av tryptofan /kg av for. Alle 4 grupper ble eksponert for en kontinuerlig fotoperiode for varigheten av forsøket.Alle 4 grupper av fisk ble veiet og målt ved overføringen av Grupper #3 og #4 til sjøvann og 2 intervaller av omtrent 30 dager deretter.Sammenligning av spesifikke veksthastigheter (SGRs) utvist av hver gruppe under 61-dagers testintervall: Figur 34 sammenligner SGRs under 2 påfølgende 30-dagers intervaller i 20 gm og 40 gm ung atlantisk laks enten behandlet med APS Prosess II og overført til sjøvann eller kontinuerlig holdt i ferskvann.SGRs for både 20 gm og 40 gm fisk holdt kontinuerlig i ferskvann var større enn begge deres parede APS Prosess II motparter i sjøvann. Gjennomsnittlig 60-dagers SGR for ferskvann 20 gm og 40 gm fisk var 1,51 og 1,45 henholdsvis. I motsetning, var SGRs i 20 gm og 40 gm APS Prosess II fisk etter overføring til sjøvann henholdsvis 65% (0,98) og 57% (0,83) av disse ferskvannsverdier. De lavere SGR verdier utvist av både 20 gm og 40 gm APS Prosess II fisk reflekterer deres adapsjon til sjøvann under dette innledende 60 dagers intervallet. Den økende adapsjonen til sjøvann er reflektert ved økninger i SGRs for både 20 gm og 40 gm APS Prosess II fisk på henholdsvis 58% og 36% under det andre 30 dagers intervallet sammenlignet med det første. Som vist i Eksempel 12, øker SGRs verdier for APS Prosess II fisk i sjøvann betydelig over det neste 60 dagers intervallet til verdier nesten doble de vist her. Disse data viser at 20 gm APS Prosess II fisken viste en større SGR sammenlignet med deres 40 gm motparter under identisk sjøvannsoverførings-betingelser.Som et resultat av deres større SGRs, var gjennomsnitts kroppsvekter og lengder av ferskvann ung laks betydelig (p<0,05) større enn tilsvarende verdier oppnådd ved APS Prosess II fisk under det 61-dagers testintervallet. Som vist i Tabell 15 så vel som Figurer 35 og 36, var den gjennomsnittlige endelige kroppsvekten oppnådd med mindre APS Prosess II fisk etter sjøvannsoverføring ved 20 gm, 73,4% av verdien oppnådd av deres matchede ferskvannskontroller. Tilsvarende, oppnådde de større APS Prosess II fiskene overført ved 40 gm kroppsvekt og vokst i sjøvann bare 71,0% av gjennomsnittlig kroppsvekt oppnådd av deres matchede kontroller. Til sammen, viser disse data at både mindre og større APS Prosess II fisk viste lignende grader av vekst under de innledende 61 dager etter sjøvannsplassering til tross for det faktum at de mindre 20 gm fiskene var én halv størrelse av deres større 40 gm motparter. Som beskrevet i Eksempel 12, resulterte fortsatt vekst av APS Prosess II fisk i sjøvann under et påfølgende 60 dagers intervall i SGRs som var 1,5-2,5 ganger dem vist i Figur 34. Sammenligning av for-omdannelses-forhold (FCRs) utvist av hver gruppe under 61-dagers testintervall: Figur 37 viser FCR data for både ferskvann og APS Prosess II sjøvannsgrupper i 2 påfølgende 30-dagers intervaller. Først, tolererte både 20 gm og 40 gm APS Prosess II fisk godt raskt switch fra fuktig til tørrfor. Til og med større av dagens industristandard smolt som veier 100 gm eller mer ville ikke tolerere denne raske reduksjon i oral vann supplementasjon.Imidlertid, viser disse data at både 20 gm og 40 gm APS Prosess II fisk var mindre effektive i å omdanne matenergi til økninger i kroppsvekt under 60 dagers intervallet etter sjøvannsoverføring sammenlignet med deres matchede kontroller vokst i ferskvann. Denne mindre effektive omdannelse av mat til biomasse av APS Prosess II fisk reflekterer deres innledende 30-dagers intervall av adapsjon til sjøvann som ble forbedret for begge størrelser av APS Prosess II fisk under deres andre 30-dagers intervall. Allikevel, var gjennomsnittlig FCR av mindre 20 gm APS Prosess II fisk (FCR (60 dag) 0,97) sammenlignbar med den vist av større 40 gm APS Prosess II fisk (FCR (60 dag) 1,0) under hele 60 dagers intervallet etter sjøvannsoverføring. Imidlertid, viste begge grupper av APS Prosess II fisk større FCRs sammenlignet med matchede kontroller vokst i ferskvann og matet identiske matrasjoner (20 gm ferskvann - FCR (60 dag) 0,78; 40 gm ferskvann - FCR (60 dag) 0,71). Disse data er i overensstemmelse med data beskrevet i Eksempel 12 hvor APS Prosess II fisk oppnår svært ønskelige FCRs på mindre enn 0,8 etter bare 60 dager etter sjøvannsoverføring.Sammenligning av daglig for-inntak utvist av hver gruppe under 61-dagers testintervall: Figurer 38 og 39 viser daglige matkonsum uttrykt som % kroppsvekt pr. dag oppnådd ved hver av de 4 grupper av ung laks. Disse fiskene ble ikke tilbudt mat inntil 48 timer etter overføring til sjøvann og ble ikke matet på dager #21,22,31,32,55 og 56 under det 61-dagers test intervallet. Som vist i Figur 38, begynte APS Prosess II fisk med en 20 gm overføringsvekt å spise umiddelbart når tilbudt mat på dag 3 selv om ved en redusert rate, sammenlignet med matchede kontroller i ferskvann. Mens mat-inntaket varierer veldig på en daglig basis (tidligere dokumentert og vidt akseptert som normalt for akvadyrkede fisk), foreslår disse data at matkonsumet av APS Prosess II fisk ikke nådde nivåer ekvivalente med dem vist av matchede ferskvannskontroller inntil omtrent 25-30 dager etter sjøvannsoverføring. Figur 39 sammenligner matkonsum av APS Prosess II fisk som veier 40 gm ved overføring til sjøvann vs. matchede kontroller gjenværende i ferskvann. På en måte som ligner den vist av 20 gm APS Prosess II fisk, krever 40 gm APS Prosess II fisk også minst 25 dager for å konsumere mat ved hastigheter som var identiske med deres ferskvanns motparter. Disse data gir ytterligere dokumentasjon av bemerkelsesverdig kort varighet av undertrykket foring av APS Prosess II fisk etter sjøvannsoverføring sammenlignet med meget større 100 gm dagens industristandard atlantisk laks smolt som ikke viser noe mat-inntak i 20 dager, eller mer etter deres overføring til sjøvann.Disse data er i overensstemmelse med en rolle av PVCR proteiner til stede på forskjellige organer som spiller nøkkelroller i føling og utnyttelse av matnæringsstoffer. Som vist i Eksempler 3-6, omfatter disse vev: lukt lamella, luktenerve og luktelapp (føling av saltholdighet og næringsstoffer), smaksevne hjernekjerner omfattende vågal lapp og aksessorisk kjerne av Cajal (regulering av tarm-motilitet og appetitt) så vel som epitelial og nevroendokrine celler lokalisert i den unge laksefiskens mage, pylorisk caeca, proksimal og distal tarm (prosessering og absorpsjon av matnæringsstoffer). Således, modulerer APS Prosess II uttrykket og/eller sensitivitet av disse PVCRs og derved forbedres både mat-inntaket og utnyttelsen av fisk etter deres overføring til sjøvann fra ferskvann.Eksempel 14: Sammenligning av sjøvannsoverføring og vekst av stor 90-100 gm industristandard atlantisk laks smolt når behandlet med enten APS Prosess I eller APS Prosess IIDisse data sammenligner sjøvann overlevelse og innledende veksthastigheter av større (90-100 gm) raskt voksende atlantisk laks smolt som ble eksponert i 6 uker for enten APS Prosess I eller APS Prosess II. Disse data viser at både APS Prosess I eller II behandlet fisk vokste ved identiske hastigheter over et 37 dagers intervall etter sjøvannsoverføring. Begge grupper hadde identisk lave post sjøvannsoverføring dødelighetsrater. Dataene viser at applikasjon av APS Prosess II til større (90-100 gm) altantiske laks gir post sjøvannsmortaliteter og veksthastigheter sammenlignbare med dem vist når identiske fisk behandles med APS Prosess I.Beskrivelse av eksperimentell protokoll: En enkelt gruppe med stor raskt voksende ung Landcatch/St John atlantisk laks som veier omtrent 90 gm ble anskaffet fra en kommersiell produsent (atlantisk laks av Main), delt opp i 2 like store grupper matchet for lengde og vekt og hver ble behandlet i 6 uker i separate tanker med enten APS Prosess I eller APS Prosess II. Individuelle fisk i hver gruppe ble deretter tagget etter å ha oppnådd sin lengde og vekt og deretter overført til en enkelt stor laboratorie sjøvannstank. Etter 37 dagers vekst i sjøvann hvor alle fiskene mottok en tørr (<9% vanninnhold) sjøvannsdiett, ble fisk målt og SGR beregnet ved anvendelse av en standard formel.Resultater: Tabell 16 sammenligner de gjennomsnittlige kroppsvekter, lengder og kondisjonsfaktorer (k) av smolt behandlet med enten APS Prosess I eller APS Prosess II umiddelbart før deres sjøvannsoverføring vs etter 37 dager av sjøvannsoppvekst (growout). Disse data viser at det ikke ble noen betydelige forskjeller mellom kroppskarakteristika av smolt behandlet med enten APS Prosess I eller APS Prosess II før sjøvannsoverføring. Både APS Prosess I og APS Prosess II fisk utviste en kombinasjon av lave mortaliteter 2-3% og betydelig vekst i kroppsvekt (omtrent 30%) og lengde (omtrent 9-10%) etter 37 dager av sjøvann vekst. Imidlertid, når kroppsvektene av APS Prosess I vs APS Prosess II fisk etter 37 dager av sjøvann-vekst ble sammenlignet var det ikke noen betydelige forskjeller, hvilket indikerer at hver gruppe med fisk hadde vokst en lignende mengde (SGR av APS Prosess I = 0,80 vs SGR av APS Prosess II = 0,86).P verdi*: sammenligner vekter, lengder og k av APS Prosess I vs APS Prosess II P verdi#: sammenligner vekter av sjøvannsoverføring vs etter 37 dag sjøvann-vekst for en enkelt type av fisk underkastet APS Prosess I eller APS Prosess II.Figurer 40A-B sammenligner vektene og lengdene av fisk behandlet med enten APS Prosess I eller APS Prosess II før sjøvannsoverføring vs etter 37 dager av sjøvann-vekst. Disse data viser at fisk som tilhører både APS Prosess I og APS Prosess II grupper vokste og opprettholdt lignende ønskelige kondisjonsfaktorer (k - se Tabell I) under dette 37 dagers intervallet av sjøvann-vekst. Tilsammen, viser disse data at applikasjon av APS Prosess II til større (90-100 gm) altantiske laks gir post sjøvannsmortaliteter og veksthastigheter under de innledende 37 dager etter sjøvannsoverføring som er sammenlignbare med dem vist når identiske fisk behandles med APS Prosess I.Eksempel 15: Sammenligning av sjøvannsoverføring og vekst av stor industristandard atlantiske lakse smolt (100-75 gm) i havgarn etter behandling med APS Prosess I eller gjenstand for dagens oppdrettsmetoder.Fisk behandlet med APS Prosess I og parede kontroller behandlet med industristandard metoder ble studert totalt i 185 dager etter sjøvannsplassering av APS behandlet fisk. Totalt 3 hovedkonklusjoner ble oppnådd hver som demonstrerer verdien og nytten av APS Prosess I: 1. Fjerning av hindingen av det konvensjonelle "smolt-vindu": Dødelighetene observert etter havgarn-plassering var lav i APS smolt (6,1%) til tross for det faktum at disse fiskene ble overført til sjøvann 1,5 måneder etter smolt-vinduet og inn i en meget høy (15,1°C) hav-vann temperatur. Dødeligheten av APS smolt er lik dem av industristandard smolt (3,3%) overført til kjøligere (10°C) sjøvann i smolt-vinduet som var 64 dager tidligere. Denne karakteristikken av APS behandlet smolt tilveiebringer en større fleksibilitet i ferskvannsklekkeri operasjoner siden plassering av APS smolt ikke er rigid definert som det konvensjonelle "smolt-vindu" nå anvendt i industripraksis.2. Raskere vekst under intervall etter sjøvannsoverføring på grunn avreduksjon eller eliminering av osmotisk sjokk: APS smolt var i topp tilstand under og umiddelbart etter sjøvannsoverføring. I motsetning til industristandard smolt som krevet minst 20 dager til å nå full foring, spiste APS smolt kraftig innen 48 timer. Videre, er de innledende veksthastigheter vist av APS smolt betydelig større enn både publiserte data for standard smolt under deres innledende 50 dager etter sjøvanns-plassering så vel som hvilken som helst SGR utvist av deres industristandard motparter under hele det 185 dagers testintervallet. Som et resultat, var APS smolt nær ved å oppnå en identisk gjennomsnittlig størrelse med industristandard smolt, til tross for det faktum atindustristandard smolt både var 25% større ved tiden for sjøvannplassering så vel som det faktum at de hadde 64 dager av tilleggstid i sjøvann. Disse data gir bevis for at APS smolt ikke var underkastet betydelig osmoregulatorisk stress, som ville forhindre dem fra spising umiddelbart.3. Reduksjon i tid for å oppnå en markeds-størrelse laks: Den raske veksten avsmolt behandlet med APS Prosess I under 96 dagers intervallet umiddelbart etter havgarn- plassering tilveiebringer tilretteleggelse av økninger i størrelsen av laks når sjøvann-veksten forløper. Således, er det antatt at disse fiskene behandlet med APS Prosess I, hvis plassert i det normale smolt- vinduet, ville nå markeds-størrelse så meget som 7 måneder tidligere sammenlignet med industristandard fisk dyrket på det samme garn-sted.Beskrivelse av eksperimentell protokoll: Det eksperimentelle design omfattende karakteristika av både APS Prosess l-behandlede og industristandard kontrollgrupper er detaljert i Eksempel 2. De innledende data for sjøvannsoverføring så vel som spesifikke veksthastigheter (SGR) for APS Prosess l-behandlede og kontroller er gitt i Tabellene 2-4.Resultater: Tabell 4 tilveiebringer data på SGRs av både APS Prosess I-behandlet og kontrollfisk etter 51 og 115 dager av sjøvann-vekst. Disse identiske undersøkelser er forlenget som vist i Tabell 17 nedenfor.Til tross for det faktum at smolt behandlet med APS Prosess I ble overført til sjøvann 1,5 måneder etter den optimale tiden dvs. "smolt-vindu" og inn i en meget høy (15,1°C) hav-vann temperatur, var deres dødelighet lignende dem av industristandard smolt (3,3%) overført til kjøligere (10°C) sjøvann innen smolt-vinduet. Denne evnen til APS Prosess I behandlet smolt tilveiebringer større fleksibilitet i lakse-farmings operasjoner siden sjøvannsoverføring av APS Prosess I behandlet smolt ikke lenger er rigid definert av det konvensjonelle "smolt-vindu".Data gitt i Tabell 17 og Figurene 6A og 42 viser at smolt behandlet med APS Prosess I viste større SGRs og øket matkonsum sammenlignet med industristandard kontroller spesielt under det innledende 96 dagers intervallet etter sjøvannsoverføring. Den totale avtagende trend av SGR's for både APS Prosess l-behandlet og kontrollfisk er godt beskrevet og primært forårsaket av den sesongbeonte reduksjon i fotoperiode under intervaller #2 og #3 når sommer glir over i høst. Som vist i Figur 6A, var matforbruket av APS Prosess I fisk under det innledende 7 dagers intervallet etter sjøvannsplassering omtrent to ganger så stort på en pr. fisk basis sammenlignet med industristandard smolt 30 dager etter deres overføring til sjøvann. Figur 41 gir en grafisk sammenligning av SGRs av APS Prosess I-behandlet fisk mot kontroll. Gjennomsnittlig SGR av APS Prosess l-behandlet fisk var 80-90% større under det innledende 64 dagers intervallet etter deres sjøvann-overføring sammenlignet med industristandard smolt. Denne større SGR-verdi er til og med mer betydelig på grunn av det faktum at APS Prosess l-behandlet fisk var omtrent 80% størrelsen av større industristandard smolt som hadde blitt overført til sjøvann 64 dager tidligere. Det er generelt akseptert at begge disse faktorene (mindre kroppsstørrelse ved tid for sjøvannsoverføring og mindre tid til akklimatisering til sjøvann) tenderer til markert undertrykked SGR-verdier. Disse data demonstrerer at atlantisk lakse smolt som behandles med APS Prosess I viser større veksthastigheter sammenlignet med kontrollfisk etter sjøvannsoverføring. Figur 42 viser økninger i både kroppsvekt og lengde av smolt behandlet med APS Prosess I etter deres overføring til sjøvann. Noter at disse fiskene behandlet med APS Prosess I opplevde en 8-ganger økning i kroppsvekt under dette 185 dagers intervallet. Som et resultat, var APS smolt (åpne kvadrater i Figur 43) nær ved å oppnå en identisk gjennomsnittlig størrelse med industristandard smolt (fylte stjerner) til tross for det faktum at disse industristandarder smolt var både 25% større ved tiden for sjøvanns- plassering så vel som det faktum at de hadde 64 dager tilleggstid i sjøvann (Figur 43). Disse data gir bevis for at APS smolt ikke var underkastet betydelig osmoregulatorisk stress, som ville forhindret dem fra umiddelbar spising og rask vekst.Som vist i Figur 43, tilveiebringer rask vekst av smolt behandlet med APS Prosess I under det 96 dagers intervallet umiddelbart etter havgarn-plassering for tilretteleggelse av økninger i størrelsen av laks etter som sjøvann-veksten forløper. For eksempel ville disse APS Prosess I fiskene hvis de både hadde samme gjennomsnitts størrelse (95,8 gm) som disse industristandarder smoltene, og var plassert i sjøvann samtidig, veie 1 620 gm istedenfor de 859 gm oppnådd av industristandard fisk i det foreliggende testintervallet. Således, ville disse fiskene behandlet med APS Prosess I nå markeds-størrelse så meget som 7 måneder tidligere, sammenlignet med industristandard fisk dyrket på det samme garn-sted.Eksempel 16: Vekst av ung atlantisk laks som har en gjennomsnittlig kroppsvekt av 26,6 gm etter behandling med APS Prosess I og overføring til sjøvann laboratorietanker for et intervall på 84 dager.Disse data viser at ung atlantisk laks med en gjennomsnittlig kroppsstørrelse på omtrent 30% av industristandard S1 smolt med hell kan gjennomføre en overføring fra ferskvann til sjøvann etter en 6 ukers behandling med APS Prosess I. Imidlertid, som større industristandard smolt, gjennomgår disse APS Prosess I fiskene et betydelig 61 dagers intervall med liten eller ingen vekst, fulgt av betydelig økninger i SGR ledsaget av reduksjoner i for-omdannelses-forhold eller FCRs.Beskrivelse av eksperimentell protokoll: Som beskrevet i Eksempel 2, ble Landcatch/St. John atlantisk laks behandlet med APS Prosess I og deretter overført til sirkulære tanker inneholdende sjøvann innen APS-laboratoriet. Førtiåtte timer etter sjøvannsoverføring, ble APS Prosess l-fisk begynt på standard fuktig (38% fuktighet) smoltfor (Connors Bros.) som hadde blitt re-pelletisert på grunn av nødvendigheten for å fremskaffe mindre størrelse for for mindre APS Prosess l-fisk sammenlignet med normal industrilaks. Dødeligheten, forkonsum, vekst og total helse av disse 108 APS Prosess I som veier 26,6 gm ble overvåket nøye, som beskrevet i Eksempel 2.Resultater: Totalt 108 fra de 140 APS Prosess l-fiskene som er listet opp i Tabell 5 ble nøye overvåket i totalt 84 dager. De gjenværende 32 fiskene fra denne gruppen ble anvendt i andre forsøk ikke angitt her.Som vist i Tabell 18, var den totale dødelighet av disse APS Prosess I-fiskene 18/108 eller 16,6%. Dødelighetsrater blant fisk som veier mindre enn 15 gm var noe større (11/108) sammenlignet med fisk som veier mer enn 15 gm (7/108). Veksthastigheter for disse APS Prosess l-fiskene var dårlig (SGR 0,375) for innledende 61 dager etter sjøvann når disse fiskene ble matet fuktig for (38% fuktighetsinnhold). Imidlertid, forbedret gjennomsnittlig SGR seg for disse fiskene under det siste 23 dagers intervallet når APS Prosess l-fisk ble matet standard tørrfor (<10% fuktighetsinnhold). Tilsvarende, var for-omdannelsesforholdet (FCR) av APS Prosess l-fisk dårlig (FCR(av) =4,19) under dette innledende 61 dagers intervallet etter sjøvannsoverføring, men forbedret seg betydelig under det siste 23 dagers intervallet (FCR 0,89). Disse data er lignende de utvist av større (100 gm) smolt overført til sjøvann ved anvendelse av dagens konvensjonelle teknikker hvor forlengede intervaller av dårlig foring og langsom vekst er rapportert. Data vist i Figur 44 gir en sammenligning av kroppskarakteristika av APS Prosess l-fisk etter 61 dagers vekst i sjøvann mot ved tiden for sjøvannsplassering. Disse data viser at denne gruppen med APS Prosess l-fisk vokste langsomt mens de opprettholdt sine passende kroppsvekt/lengde-forhold til tross for det faktum at de ble matet fuktig for. Tilsammen, viser disse data at APS Prosess l-fisk med hell kan gjennomgå sjøvannsoverføring på en måte nesten identisk med den angitt for større industristandard atlantiske laksesmolt (100 gm) men har en gjennomsnittlig kroppsvekt som er omtrent én tredjedel av den til sine større motparter.Eksempel 17: Differensiell overlevelse av ung atlantisk laks under de innledende 72 timer etter overføring til sjøvann etter å ha fått diettopplegg inneholdende forskjellige PVCR- agonister.Totalt 3 PVCR-aminosyre-agonister (tryptofan, tyrosin og histidin) ble testet og deres evne til å forbedre overlevelsen av ung atlantisk laks under det innledende 72 timers intervall etter overføring til sjøvann ble målt. Dataene beskrevet her viser at inntak av tryptofan i dietten til ung atlantisk laks er betydelig mer effektiv sammenlignet med enten tyrosin eller histidin ved økende overlevelse av fisk etter overføring til sjøvann. Inntak av en annen PVCR-agonist (MgCfe) sammen med tryptofan forbedrer ikke overlevelse i sjøvann sammenlignet med tryptofan alene.Beskrivelse av Eksperimentell forskrift: Ung atlantisk laks (St. John/St. John stammen) som har en gjennomsnittsvekt på omtrent 15 g (område 5,50-30,5g) som stammet fra en enkel klekking ble delt i identiske tilsvarende grupper på 45 fisk hver og holdt i enten ferskvann (kontroll) eller ferskvann inneholdende 3 mMCa2+ og 1 mM Mg 2+. Fiskens for ble formulert og fremstilt som beskrevet i Eksempel 8 ved anvendelse av 1 av 3 aminosyrer, og fisk ble matet to ganger daglig i et tidsrom på 14 dager. Fisk ble deretter overført til sirkulære tanker inneholdende sjøvann i APS-laboratoriet. Mortaliteter ble kvantifisert hver 24 timer og etter 72 timer ble differensielle mortaliteter sammenlignet. Alle fisk ble utsatt for en kontinuerlig fotoperiode under målingets varighet.Resultater: Tabell 19 viser mortaliteter observert etter overføringen av ung laks til sjøvann. En sammenligning av totale mortaliteter observert under det 72 timers eksperimentelle tidsrom er vist på Figur 45. I motsetning til den innledende overføring til sjøvann redusertes dødeligheten av ung kontroll-laks som ble holdt i ferskvann og bare fikk standardfor (44%), tilsetning av hvilken som helst av 5 PVCR-modulatorene reduserte betydelig (p< 0,05) dødelighet ved overføring til sjøvann. Diet-tilsetning av 7% NaCI alene [#2] (APS Prosess I) ga en 50% reduksjon i dødelighet sammenlignet med inntak av både 7%NaCI + tryptofan [#3](APS-Prosess II) som reduserte innledende mortaliteter ved overføring til sjøvann til mindre enn 9%.TABELL 19: Mortaliteter observert under de innledende 72 timer etter overføring til sjøvann i individuelle grupper (n=45 gjennomsnittsvekt 15 g) av ung atlantisk laks underkastet tidligere diett-opplegg i 14 dager. Bmrk.: Alle fisk i grupper #2-6 ble holdt i vann inneholdende 3mM Ca2+ og 1 mM Mg2* i et 2-ukers tidsrom før overføring til sjøvann.Denne lave dødelighet blir ikke endret (p>0,3) ved inntak av en tredje modulator med PVCR-funksjon i dietten (7%NaCI + 2 g/kg tryptofan + 2% MgCI2)[#6]. Derimot resulterte tilsetning av enten tyrosin eller histidin i betydelig lavere reduksjoner i mortaliteter etter overføring til sjøvann (henholdsvis 20% og 31%) sammenlignet med tryptofan (8,9%).Eksempel 18: Demonstrasjon av anvendeligheten av fastfase-enzym-bundet måling for påvisning av PVCR'er i forskjellige vev hos individuelle atlantiske laks ved anvendelse av anti-PVCR-polyklonalt antiserum.PVCR-innholdet av forskjellige vev hos fisk kan kvantifiseres ved anvendelse av et ELISA 96-brønners platemålingsystem. Dataene som er beskrevet her demonstrerer anvendeligeten av en 96 brønners ELISA måling for å kvantifisere vevsinnholdet av PVCR- protein ved anvendelse av et kanin-polyklonalt anti-PVCR-antistoff anvendt for å utføre immunocytokjemi og western blotting. Disse data danner basis for utvikling av kommersielle målesett som ville regulere ekspresjonsnivåene av PVCR-proteiner i forskjellige vev hos unge anadrome fisk som gjennomgår prosessene i den foreliggende oppfinnelse som beskrevet her. Sensitiviteten av denne ELISA blir demonstrert ved måling av det relative PVCR-innhold i 14 vev fra en enkelt ung atlantisk laks som vist i Figur 46.Homogenisater ble fremstilt ved å plassere forskjellige vev av ung atlantisk laks (St. John/St. John stamme gjennomsnittsvekt 15-20 g) i en buffer (10 mM HEPES, 1,5 mM MgCI2,10 mM KCI, 1mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), 0,5 ditiothreitol (DTT) og 1mM benzamidin pH 8,8) og ved anvendelse av en standard Potter-Elvenhiem glass- homogenisator med en roterende pistill. Etter sentrifugering ved 2550 xg i 20 min. ved 4°C for å fjerne større avfall ble supernatanten enten anvendt direkte eller frosset ved -80°C inntil videre anvendelse. Homogenisatproteinkonsentrasjoner ble bestemt ved anvendelse av BCA- målesett (Pierce Chem. Co.). Alikvoter av individuelle vevshomogenisater ble fortynnet til en konstant alikvotstørrelse på 100 mikroliter, og hver ble overført til en 96-brønners plate (Costar Plastic Plates) og fikk tørke i romluft i 15 timer. Etter blokkering av ikke-spesifikk binding med en løsning av 5% ikke-fett melkepulver + 0,5% Tween 20 i TBS (25 mM Tris 137 mM natriumklorid, 2,7 mM KCI pH 8,0), primært antiserum (enten kanin-anti-PVCR- immun eller tilsvarende kanin pre-immun-antiserum) ved en 1:1500 fortynning. Etter en 1 times inkubering ble de individuelle brønner skyllet 3 ganger med 500 mikroliter TBS, et 1:3000 pepperrotperoksydase-konjugert geit-anti-kanin (Gibco-BRL) ble tilsatt og fikk inkuberes i 1 time. De enkelte brønner ble deretter skyllet og bundet kompleks av primært-sekundært antistoff detektert med Sigma A3219 2,2'-azino-bis(3-etylbenztiazidin-6-sulfonsyre) fargereagens etter 15 min. inkubering ved anvendelse av en Molecular Devices 96-brønners plateleser (Molecular Devices, VMAKS) ved 405nm. Relative mengder av vevets PVCR-innhold ble bestemt etter korreksjoner for minimal bakgrunn og ikke-spesifikk antistoffbinding målt ved binding av preimmunt antiserum.Figur 46 viser dataene oppnådd fra en representativ eneste ELISA-bestemmelse av PVCR-proteininnhold av 14 vev fra en eneste ung atlantisk laks. Under betingelsene spesifisert i den Eksperimentelle protokoll som er beskrevet ovenfor ble ikke-spesifikk binding av både primære og sekundære antistoffer ble minimalisert. Skjønt disse kvantitative verdier blir målt i forhold til hverandre og ikke i absolutte mengder, gir de data som er parallelle omfattende immunocytokjemisk undersøkelse av hvert av vevene. Bemerk at PVCR-innholdet i forskjellige organer reflekterer deres betydning ved osmoregulering av atlantisk laks. Immunocytokjemiske data beskrevet her viser at vev så som tarmer, (proximale og distale segmenter), gjeller, urinblære og nyre inneholdt PVCR protein. I hvert tilfelle uttrykker epitelceller i kontakt med fluider som væter overflatene av disse vev PVCR. Derimot inneholder andre organer omfattende lever, hjerte og muskel minimalt PVCR- protein. Bemerk at det høyeste PVCR- innhold i hvilket som helst vev testet er "lukteorganlameller" hvor laks har evnen til å "lukte" endringer i kalsiumkonsentrasjon i vann. "Luktekolbe" inneholdende neuroner som stimulerer "lukteorganlameller" har også rikelig PVCR. Til sammen demonstrerer disse data nytten av ELISA-sett for å måle vevsinnhold av PVCR-proteiner og danner basis for utvikling av kommersielle målesett som ville kontrollere ekspresjonsnivåene av PVCR-proteiner i forskjellige vev av unge anadrome fisk som gjennomgår prosessene i foreliggende oppfinnelse. Endringer i PVCR-vevinnhold målt i enten relative endringer i vevs-PVCR-innhold eller absolutt mengde av PVCR pr. vevsmasse kunne igjen anvendes som korrelativ måling for å bestemme modenheten av unge anadrome fisk for sjøvannsoverføring eller begynnelse av foring. Disse data demonstrerer evnen til å utføre slike målinger på individuelle unge atlantisk laks i området av kroppstørrelser som ville anvendes til overføring av fisk fra ferskvann til sjøvann etter behandling ved metodene ifølge foreliggende oppfinnelse.Eksempel 19: Antistoffer fremstilt fra den karboksylterminale del av et atlantisk laks PVCR- protein er effektive i immunocytokjemi og immunoblottingsmåling for å bestemme tilstedeværelse, fravær eller mengde av PVCR-proteinet.Degenererte primere, SEKV ID NR'ere: 22 og/eller 23, beskrevet her ble konstruert spesifikt fra SKCaR DNA-sekvensen. Disse primere har vist seg å være anvendelige reagenser for amplifisering av deler av PVCR-sekvenser fra både genomisk DNA så vel som cDNA (se Eksempel 20).For å oppnå mer cDNA-sekvens fra anadrome fisk PVCR'er ble spesielt den antatte aminosyresekvens av det karboksylterminale domene av PVCR'er som er mål for dannelse av spesifikke peptider, og som et resultat, spesifikke anti-atlantisk laks PVCR-antisera, et ikke-amplifisert cDNA-bibliotek fra tarmer hos atlantiske laks konstruert. Fag-plaquer som stammer fra dette cDNA-bibliotek ble undersøkt under høy stringens ved bruk av 32P-merket 653 bp genomisk atlantisk laks PCR-produkt (SEKV ID NR.: 1). Fra denne cDNA-biblioteks-undersøkelses ble et 2021 bp cDNA-klon isolert og inneholdt en enkel åpen leseramme for en antatt aminosyresekvens svarende til omtrent halvparten av en fullstendig cDNA-sekvens fra et tarm-PVCR-protein. Denne antatte aminosyresekvens svarer nøyaktig til sekvensen som blir kodet for av den tilsvarende genomiske probe så vel som den aminosyresekvens svarende til det karboksylterminale domene av PVCR.På basis av kunnskapen om denne antatte aminosyresekvens ble et peptid vist nedenfor syntetisert og svarte til en separat region av den antatte karboksylterminale PVCR-aminosyresekvens:som produserer kanin-antiserum SAL-1Peptidet ble derivatisert til bærerproteiner og anvendt til å frembringe peptidspesifikt antiserum i to kaniner ved anvendelse av metoder for fremstilling av et polyklonalt antistoff.Det resulterende peptidspesifikke antiserum ble deretter testet ved anvendelse av både immunoblottings- og immunocytokjemi-teknikker for å bestemme hvorvidt antistoffet bundet til proteinbånd svarte til PVCR-proteiner eller ga merkingsmønstere lignende de som ble dannet ved anvendelse av annet anti-PVCR-antiserum. Et fotograpfi av en immunoblot ble tatt som viser proteinbånd som ble gjenkjent av antisera dannet mot peptider inneholdende enten SAL-1(SEKV ID NR.: 24) eller SKCaR (SEKV ID NR.:18) (Figurer 28A-E). Som forventet dannes antiserum mot det peptididentifiserte proteinbånd som co-elektroforeserer med PVCR-proteiner som blir gjenkjent av antisera dannet mot SKCaR (SEKV. ID NR.:18). Immunomerking av unge atlantisk laksenyredeler med 3 forskjellige anti-PVCR antisera (anti-Sall, anti-4641 og anti-SKCaR) gir lignende lokaliseringer av PVCR-protein i tubuler av laksenyre. Merking dannet med anti-SKCaR-antiserum er identisk med den produsert med anti-4641-antiserum, et anti-peptid-antiserum svarende til det ekstracellulære domenet av pattedyr-PVCR'er som er meget likt SKCaR (SEKV ID NR.: 18). Disse PVCR-protein- mønstere ble merket identiskmed det som var dannet med SAL-1 antiserum. Anti-Sal-1 antiserum viser også et lignende merkingsmønster for fordelingen av tarm-PVCR-protein, sammenlignet med anti-SKCaR. Således er dette nye antiserum spesifikt for en PVCR i atlantisk laksevev. Dette antiserum kan anvendes for å bestemme tilstedeværelse, fravær eller mengde av PVCR i forskjellige vev fra fisk ved anvendelse av metodene beskrevet her.Eksempel 20: Anvendelse av reverstranskriptase-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) til å detektere ekspresjon av PVCR'er i forskjellige vevI Eksempel 1 er 2 degenererte primere, SEKV ID NRs.: 22 og 23 beskrevet. Disse to primere ble anvendt til å amplifisere genomisk DNA og oppnå sekvensen av en del av genomiske DNA-sekvenser av PVCR'er fra forskjellige anadrome fisk. Disse samme primere kan også anvendes til å amplifisere en del av tilsvarende PVCR-mRNA-transkripter i forskjellige vev. DNA-sekvensanalyser amplifiserte cDNA'erfra spesifikke atlantisk lakse- vev (lukteorganlameller, nyre, urinblære) er alle identiske med visse genomiske PVCR- sekvenser beskrevet her, f.eks. SEKV ID NR 1-atlantisk laks. Disse data viser at: 1. PVCR mRNA-transkripter blir faktisk uttrykt i spesifikke vev hos anadrome fisk. Disse data forsterker dataene angående PVCR-proteinekspresjon som som ble detektert med anti-PVCR-antisera. 2. RT-PCR-metoder kan anvendes til å detektere og kvantifisere graden av PVCR-ekspresjon i forskjellige vev som et middel til å forutsi modenheten av anadrome fisk for overføring til sjøvann. 3. cDNA-prober kan dannes fra spesifikke vev hos anadrome fisk foranvendelse som spesifikke DNA-prober til enten å detektere PVCR-ekspresjon ved anvendelse av løsnings- eller fastfase-DNA-DNA- ellerDNA-RNA-nukleinsyrehybridisering eller oppnå antatte PVCR-proteinsekvenser anvendt for dannelse av spesifikke anti-PVCR- antisera.Totalt RNA ble renset fra utvalgt vev ved anvendelse av Teitest B reagens (Frienderwood, TX) og medfølgende standardforskrift. Totalt 5 mikrogram av totalt RNA ble reverstranskribert med oligo-dT-primere ved anvendelse av lnvitrogen's cDNA Cyklus Kit (Invitrogen Inc, Madison, Wl). Det resulterende cDNA-produkt ble denaturert og en andre renserunde ble utført. To mikroliter av den resulterende reaksjonsblanding ble amplifisert i en PCR-reaksjon (30 cykler på 1 min. @ 94°C, 2 min. @ 57°C, 3 min. @72°C) ved anvendelse av degenererte primere SEKV ID NR 22 og 23. De resulterende produkter ble elektroforesen på en 2% (vekt/volum) agarosegel ved anvendelse av TAE-buffer inneholdende etidiumbromid for deteksjon av amplifiserte cDNA-produkter. Geler ble fotografier! ved anvendelse av standard laboratoriemetoder.Totalt 15 mikroliter atlantisk laks' urinblære-, nyre- og neselamell-RT-PCR-reaksjonsblandingerer ble fortynnet i 40 mikroliter vann og renset ved størrelseseksklusjon på AmershanrVs MicroSpin S-400 HR-spinnkolonner (Amersham Inc, Piscataway, NJ). Renset DNA ble sekvensert ved anvendelse av degenererte PVCR-primere (SEKV ID NR.: 22 og 23) som sekvenseringsprimere. Automatisert sekvensering bie utført ved anvendelse av en Applied Biosystems Inc. Modell 373A Automated DNA Sequencer (University of Maine, Orono, Maine). De resulterende DNA-sekvenser ble oppstilt ved anvendelse av MacVector (GCG) og LaserGene (DNA STAR) sekvensanalyse-programvare.Deteksjon av amplifiserte RT-PCR cDNA-produkter ved Southern Blotting: Alternativt ble tilstedeværelsen av amplifiserte PVCR-produkter detektert ved Southern blotting-analyser av gelfraksjonerte RT-PCR-produkter ved anvendelse av et 32P-merket 653 bp atlantisk laks amplifisert genomisk PCR-produkt (SEKV ID NR.: 1). Totalt 10 mikroliter av hver PCR reaksjon ble elektroforesert på en 2% agarosegel ved anvendelse av TAE-buffer og deretter blottet på Magnagraph membran (Osmonics, Westboro, MA). Etter uv-kryssbinding av DNAet ble blotter prehybridisert og deretter probet natten over (68°C i 6X SSC, 5X Denhardfs Reagens, 0,5% SDS, 100ug/ml kalve-thymus-DNA) med 653 bp atlantisk laks-PCR-produktet (merket med RadPrime DNA Labeling System, Gibco Life Sciences). Blotter ble deretter vasket med 0,1 x SSC, 0,1% SDS @ 55°C og underkastet autoradiografi under standardbetingelser.Figur 47 viser resultatene av RT-PCR-amplifisering av et partielt PVCR mRNA- transkript fra forskjellige vev av ung atlantisk laks. RT-PCR-reaksjoner ble separert ved gel- elektroforese og enten merket i etidiumbromid(EtBr) eller overført til en membran og Southern blottet ved anvendelse av et 32P-merket 653 bp genomisk DNA-fragment fra atlantisk laks-PVCR-gen. Figur 47 viser deteksjonen av PVCR i mange vevstyper av atlantisk laks ved anvendelse av RT-PCR-metoden som beskrevet her. Typene av vev er gjelle, neselameller, urinblære, nyre, tarm, mage, lever og hjerne.Eksempel 21: Behandling av ung atlantisk laks med APS-prosess II gir endringer i både strukturen og funksjonen av gjelle-epitelceller som forbereder disse fisk for mer effektive gjellefunksjoner som er nødvendig for overlevelse etter overføring til sjøvannDataene beskrevet her viser at gjelle-klorid-celler fra ung atlantisk laks har et PVCR- protein og at som respons på behandling med APS-Prosess II endrer ung atlantisk laks fordelingen av gjelle-klorid-celler lignende den som blir produsert ved overføring til sjøvann, bortsett fra at disse fisk forblir i ferskvann. Videre viser dataene beskrevet her at som respons på behandling med APS-Prosess II, dobler gjellene (men ikke "pyloric caeca") av ung atlantisk laks som forblir i ferskvann sin Na+ K+ ATPase-aktivitet på en lignende måte som den hos fisk som blir overført til sjøvann. Til sammen gir disse data sterkt grunnlag som tyder på at PVCR-proteinet til stede på gjelle-klorid-celler responderer på behandling av fisk ved APS-Prosess II og endrer både fordelingen og Na+ K+ ATPase-aktiviteten til klorid-celler på en måte som ligner meget prosessen etter at fisk blir overført til sjøvann. Denne behandling av anadrome fisk ved APS-Prosess II gir raskere tilpassing og bedre virkning og vekst etter overføring av ung atlantisk laks til sjøvann.De følgende parametere er blitt etablert for gjelle-klorid-celler i anadrome fisk tilpasset ved APS-Prosess I: 1. Anti-Na+ K+ ATPase-antistoff kan anvendes for å lokalisere klorid-celler i parafin- deler av gjellelameller. Fordelingen av klorid-celler i både primære og sekundære lameller av salmonidgjeller kan anvendes som en indikator for å spore hvorledes gjellen endres etter overføringen av fisk under APS-Prosessen. 2. Na+ K+ ATPase-aktivitet til stede i homogenisater av gjellevev kan kvantifiseres ved anvendelse av metoder beskrevet her (f.eks. en enzymatisk måling). Siden den hoveddelen av Na+ K+ ATPase-enzym foreligger i klorid-celler, blir endringer i graden av Na+ K+ ATPase- enzymaktivitet anvendt som indikator for endringer i gjelle-klorid-celleaktivitet. Generelt øker Na+ K+ ATPase-aktivitet betydelig når ferskvannstilpassete salmonider blir overført til sjøvann og endrer sine gjeller til dette nye hyperosmotiske miljø.Som detaljert forklart nedenfor ble begge teknikker anvendt til å demonstrere endringer i fordelingen og aktiviteten til gjelle-klorid-celler hos unge atlantiske laks. Disse endringer som opptrer etter behandling av fisken med APS-Prosess II er lignende de som opptrer i salmonider som blir overført til sjøvann.Na+,K+-ATPase-aktivitet ble målt i rå homogenisater av gjelle og "pyloric caeca" (renset for fett) ved metoden til McCormick (McCormick, SD 1993. Metoder for ikke-lethal gjelle-biopsi og måling av Na+,K+-ATPase-aktivitet. Can. J. Fish Aquat. Sei. 50, 656-658). En 96-brønners plateleser ble anvendt (VERSAmax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). I korthet ble vev dissekert og frosset i alikvoter av iskald SEI buffer (300 mM sukrose, 20 mM EDTA, 50 mM imidazol, pH 7,3) og lagret ved -80°C. Prøver ble tint umiddelbart før måling, og en alikvot av SEID (SEI-buffer med 0,5 % natriumdeoksycholat) ble tilsatt for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 0,1% natriumdeoksycholat. Prøver ble homogenisert i en Kontes Dual Tissue Grinder (teflon/glass) og sentrifugert ved 5000 g i 2 min for å fjerne uoppløselig materiale. Aktivitet ble målt i 10 mikroliters I alikvoter av homogenisater i duplikater i måle- blandinger med og uten ouabain (0,5 mM). Måleblandinger var som følger: 2,1 mM PEP, 0,53 mM ATP, 0,29 mM NADH, 3 U/ml LDH, 3,75 U/ml PK, 47,25 mM NaCI, 2,63 mM MgCI2,10,5 mM KCI i 50 mM imidazol, pH 7,5. Den lineære hastighet av NADH- forsvinning ble målt ved 340 nm i 10 min. Na+,K+-ATPase-aktiviteten ble beregnet fra forskjellen i ATP-hydrolyse med eller uten ouabain og normalisert for proteininnhold i brønner. Protein ble analysert i en plateleser med den Coomassie-baserte Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA).Klorid-celler av unge atlantiske laks i sjøvann er overveiende lokalisert på de primære lameller i gjellene: Salmonid-gjeller er sammensatt av strukturer betegnet lameller som inneholder forskjellige epitelceller og blodkapillarer. Som vist ved parafinavsnitt av gjelle- lameller inneholder hver primære gjelle-lamell en rekke sekundære lameller. Fotografier av disse avsnitt ble tatt. I sjøvannstilpassete salmonider (f.eks. fisk ikke underkastet metodene ifølge foreliggende oppfinnelse), er klorid-celler som er identifisert ved prominent merking med Na+ K+ ATPase-antiserum nesten utelukkende lokalisert på primær lameller, hvor de er lokalisert på hver side av bunnen til de sekundære lameller.Klorid-celler av unge atlantiske laks er lokalisert på både primære og sekundære gjelle-lameller. Avsnitt av gjelle-lameller ble merket med enten en anti-Na+K+ ATPase eller anti-PVCR-antiserum og fotografier av disse avsnitt ble tatt. Klorid-celler inneholder betydelige mengder av et PVCR-protein. Gjeller fra parete unge atlantiske laks tilpasset ferskvann har en forskjellig fordeling av klorid-celler, sammenlignet med fordelingen til stede i sjøvannstilpasset fisk. Imidlertid ble i flere målinger hvor fisken var underkastet APS- Prosess II fordelingen av klorid-celler i gjellen slik forskjøvet at det ble en betydelig reduksjon i antallet klorid-celler i de sekundære lameller som ligner mønsteret viste ved fisk overført til sjøvann enda den behandlete fisk forble i ferskvann. I fisk holdt i ferskvann er klorid-celler lokalisert i omtrent likt antall i både primære og sekundære lameller av gjelle-vev. Derimot når slik fisk blir overført til sjøvann, endres denne fordelingen slik at det blir betydelig færre klorid-celler observert i sekundære lameller. Slimhinneceller ble ikke merket med Na+ K+ ATPase-antiserum.Immunomerking av avsnitt i nabostilling med anti-PVCR-antiserum viser at både klorid-celler så vel som slimhinneceller inneholder betydelige mengder av PVCR-protein. Se Eksempel 3 hvor tilstedeværelsen av PVCR-protein i anadrome fiskegjeller ble vist ved immunoblotting av SDS-PAGE-separerte gelproteinbånd. Disse data viser at både klorid- og slimhinneceller i gjellen har et PVCR-protein og kan således føle den ioniske sammensetning av vann som strømmer over gjellevev.Fordelingen av klorid-celler i unge atlantiske laks underkastet APS-Prosess II er lignende den vist ved sjøvannstilpasset fisk, selv om de APS-Prosess II behandlete fisk forblir i ferskvann. Avsnitt av gjellevev viser fordelingen av gjelle-klorid-celler i parete fisk behandlet ved APS-Prosess II i en varighet på 45 dager. Fordeling av klorid-celler er lignende den viste ved sjøvannstilpassete fisk, selv om disse fisk har forblitt i ferskvann. Fordelingen av klorid-celler til stede på sekundære lameller (SL) i forhold til primære lameller (PL) kan uttrykkes som et forhold som vist i Figur 48. Bemerk at SL/PL-forhold er omtrent 1 for ferskvannstilpassete laks, mens det for sjøvannstilpassete fisk er omtrent 0,1. Derimot viser parete fisk behandlet ved APS-Prosess II et SL/PL-forhold på 0,3-0,4. Denne verdi er betydelig forskjellig fra fisk holdt i ferskvann og nærmer seg verdien vist ved fisk tilpasset sjøvann. Samlet sett gir disse data indisier på endringen av gjelle-klorid-celler som likner den som foreligger i sjøvannstilpassete fisk. Tilstedeværelsen av PVCR-protein i gjelle-klorid-celler tillater klorid-celler å føle endringer i det ioniske miljø som omgir klorid-cellen og tillater den å endre seg tilsvarende.Behandling av ung atlantisk laks ved APS-Prosess II øker Na+ K+ ATPase-aktivitet i homogenisater av gjeller på en lignende måte den beskrevet etter overføring av laks til sjøvann. Figur 49 viser sammenligninger av Na+K+ ATPase-aktivitet til stede i homogenisater fremstilt fra enten gjeller eller "pyloric caeca" isolert fra parete unge atlantiske laks som ble enten holdt i ferskvann eller behandlet ved APS-Prosess II totalt 45 dager. Na+K+ ATPase-aktivitet fra gjeller av fisk behandlet med APS-Prosess II er omtrent den dobbelte av aktiviteten til stede i gjeller fra parete ferskvannsfisk. Denne betydelige forskjell (8,10 +/-3,87 overfor 3,76+/- 0,94 p<0,0008) er spesifikk siden Na+ K+ ATPase-aktiviteter fra "pyloric caeca" fra disse samme fisk (11,0+/-1,76 overfor 11,1+/-1,71, p<0,35) ikke er betydelig forskjellig.Overføring av ung salmonid fisk til sjøvann gir en betydelig økning i Na+K+ ATPase-aktivitet som reflekterer endringen av gjelle-klorid-celler til for å sette dem i stand til å fjerne NaCI fordøyet og absorbert av fisk etter begynnelsen av å drikke sjøvann. Samlet viser dataene beskrevet her at APS-Prosess ll-behandling av ung atlantisk laks øker gjellenes Na+K+ ATPase-aktivitet mens fisk forblir i ferskvann forut for deres overføring til sjøvann. Denne økning i Na+K+ ATPase-aktivitet synes spesifikk for gjeller siden en lignende økning ikke forekommer ved et annet organ rikt på Na+K+ ATPase-aktivitet i samme parete fisk.Dataene beskrevet her viser at behandling av ung atlantisk laks ved APS-Prosess II gir selektive endringer i aktiviteten til Na+K+ATPase-enzym i osmoregulerende organer i fisken. Disse data viser at APS-Prosess II forårsaker spesifikke økninger i Na+ K+ ATPase-aktivitetene til spesifikt vev som forekommer før overføringen av ung atlantisk laks til sjøvann. Disse data gir direkte molekylært bevis på at APS-Prosess II i ferskvann etterlikner økningen i Na+ K+ ATPase-aktivitet som normalt forekommer i industri-standardfisk bare etter de er overført til sjøvann.Som respons på behandling ved APS-Prosess II øker Na+ K+ ATPase-aktiviteten til gjellene, men ikke "pyloric caeca" av ung atlantisk laks som forblir i ferskvann betydelig deres Na+ K+ ATPase-aktivitet på en lignende måte til den av fisk overført til sjøvann. Disse data gir direkte bevis med hensyn til hvorledes behandling ved APS-Prosess II øker overlevelsen av ung atlantisk laks etter deres overføring til sjøvann. Istedenfor økninger i gjellenes Na+ K+ ATPase-aktivitet som forekommer på en forsinket måte etter overføring av ung fisk til sjøvann, øker gjellenes Na+ K+ ATPase-aktivitet under APS-Prosess ll-behandlingen i ferskvann og er således forhøyet før overføring til sjøvann. Denne behandling av anadrome fisk med Prosess II gir raskere tilpasning og bedre ytelse og vekst etter overføring av ung atlantisk laks til sjøvannDet membranbundete Na+ K+ ATPase-enzym er en nøkkeldel av fiskens evne til å opprettholde sin kroppsammensetning både i ferskvann og sjøvann. Som beskrevet ovenfor er klorid-celler i gjellene rike kilder til dette enzym. Endringene i gjelle-klorid-celler og Na+ K+ ATPase-enzymaktivitet for fisk ikke underkastet trinnene ifølge foreliggende oppfinnelse er vist i Figur 50. Se Seidelin et al., Physiol Biochem Zool. 73(4):446-53 (2000). Data i Figur 50 viser en betydelig forsinkelse mellom begynnelse av cellulære responser på saltinnhold-endringer og aktivering av kritiske ionetransport-mekanismer hos unge salmonider. Figur 50 sammenlikner endringene i Na+ K+ ATPase-enzym-aktivitet i gjellevevs-homogenisater f ra ferskvannstilpasset ung ørret (kroppsvekt 51 g gjennomsnittlig) enten de blir holdt i ferskvann [åpne parenteser] eller etter deres overføring til 25ppt (3/4 sjøvann) [lukkete parenteser]. Innen 12 timer etter overføring til sjøvann er det betydelige økninger i mRNA for Na+ K+ ATPase-enzymet (Figur 50, Panel A) så vel som en 50% reduksjon i antallet av Na+ K+ ATPase-immunoreaktivitet(NKIR)klorid-celler i de sekundære gjelle-lameller. Imidlertid forekommer betydelige økninger i aktiviteten til Na+ K+ ATPase-enzymet ikke inntil 5 dager etter overføring til sjøvann. Dette forsinkelsesintervall (vist ved trippelunderstrekning) representerer tidsintervallet hvor unge salmonider er meget stresset mens de prøver å raskt endre sitt nøkkel-osmoregulerende vev så som gjeller for å passe til det nye hyperosmotiske sjøvannsmiljø. Hvis de ikke oppnår økningene i gjellenes Na+ K+ ATPase-enzymaktivitet vil de dø av elektrolyttubalanse. Som beskrevet her er evnen til å overleve dette tidsrom avhengig av størrelsen til fisken (kritisk størrelse).Derimot endrer ung atlantisk laks behandlet ved APS-Prosess II i ferskvann både sin fordeling av NKIR(klorid)celler samt øker sine gjellers Na+ K+ ATPase-enzymaktivitet i ferskvann før overføring av dem til sjøvann som detaljert beskrevet i teksten Gjellebeskrivelse. Som vist i Figur 49 viser sammenligning av Na+ K+ ATPase-enzymaktiviteter i gjeller og "pyloric caeca" fra fisk holdt i ferskvann eller umiddelbart etter behandling ved APS-Prosess II betydelig økning i Na+ K+ ATPase-enzym i gjeller, men ikke i "pyloric caeca". Figur 49 viser en sammenligning av Na+K+ ATPase-aktivitet i homogenisater fra gjeller og "pyloric caeca" av ung atlantisk laks som enten ble holdt i ferskvann eller behandlet i 45 dager ved Prosess II i ferskvann. Stjerne (*) betyr betydelige (p<0,05) økninger i enzymaktivitet i gjeller.Således endrer behandling med APS-Prosess II ikke ganske enkelt Na+ K+ ATPase-enzym- aktiviteter i alle organer, men disse økninger er begrenset til selektive organer. Elimineringen av de 96 timer forsinkelse i økningen av Na+ K+ ATPase-enzym-aktiviteter vist i Figur 50 oppnådd med industristandardfisk gir direkte bevis på at APS-Prosess II gir fysiologiske endringer i atlantisk laks som forekommer i ferskvann under APS-Prosess II istedenfor sjøvann. Etter overføring av APS-Prosess I l-behandlet fisk til sjøvann er disse endringer allerede manifestert således at de gir disse fisk en evne til umiddelbar tilpasning til det nye sjøvannsmiljø uten et intervall med osmoregulerende stress eller død.Eksempel 22: PVCFTer kan føle spesifikke aminosyrer i nærvær av ekstracellulært kalsiumHai-nyre-kalsiumreseptoren (SKCaR) har evnen til å føle spesifikke aminosyrer i nærvær av ekstracellulært kalsium (1-10 mM). Dataene beskrevet her viser at SKCaR'er som føler aminosyrer forekommer i et område av ekstracellulært kalsium som er til stede i forskjellige kammere i en fisks kropp omfattende serum og kroppshulrom omfattende tarm, "pyloric caeca" og nyre, hvor transepitelial aminosyre-absorpsjon forekommer.Full-lengde rekombinant småhai (Squalus acantias) hai-nyre-kalsiumreseptor (SKCaR) (SEKV ID NR.: 17) ble uttrykt i humane embryone nyreceller. SKCaR cDNA ble ligert inn i pattedyrekspresjonsvektoren PCDNA II og transfektert i HEK-celler ved anvendelse av standardteknikker. Tilstedeværelsen av SKCaR-protein i transfekterte celler ble verifisert ved western blotting. Aktivering av SKCaR og dens evne til å respondere på individuelle aminosyrer eller blandinger derav ble kvantifisert ved anvendelse av en godt karakterisert FURA-2-forhold avbildningsfluorescensmåling hvor økninger i intracellulært Ca2+ produsert ved SKCaR-aktivering blir detektert og uttrykt som % normalisert intracellulær kalsium respons på reseptoraktivering. Bai, M., S. et al., J. Biol. Chem., 32:19537-19545 (1996); Conigrave, A, et al., Proe. Nat. Acad. Sei. 97:4814-4819(2000).Figur 51 viser en sammenligning av fluorescenssporinger FURA-2-belagte celler som stabilt uttrykker SKCaR som ble badet i fysiologisk saltvann (125 mM NaCI, 4mM KCI, 0,5 mM CaCI2, 0,5 MgCI2, 20 mM HEPES (NaOH), 0,1% D-glukose pH 7,4) i nærvær eller fravær av 10 mM L-isoleucin (L-lle) før de blir plassert i fluorimeteret. Ekstracellulær Ca2+ grunnlinjekonsentrasjon var 0,5 mM. Alikvoter av Ca2+ ble tilsatt for å gi endelige ekstracellulære konsentrasjoner av 2,5 mM, 5mM, 7,5mM, 10mM og 20 mM Ca2+ med endringer i registrert fluorescens. Bemerk at økninger i cellefluorescens var større i nærvær av 10mM Phe for ekstracellulære Ca2+ -konsentrasjoner mindre enn 10 mM. Figur 52 viser data plottet fra multippel måling som beskrevet i Figur 51 hvor virkningene av 10 mM fenylalanin (Phe), 10mM isoleucin (Ile) eller en aminosyreblanding (AA-blanding) inneholdende alle L-isomerer i de følgende konsentrasjoner i mikromol/liter: 50 Fenylalanin (Phe), 50 Tryptofan (Trp), 80 Histidin (His), 60 Tyrosin (Tyr), 30 Cystin (Cys), 300 Alanin (Ala), 200 Treonin (Thr), 50 Asparagin (Asn), 600 Glutamin (Gin), 125 Serin (Ser), 30 Glutaminsyre (Glu), 250 Glycin (Gly), 180 Prolin (Pro), 250 Valin (Val), 30 Metionin (Met), 10 Asparaginsyre (Asp), 200 Lysin (Lys), 100 Arginin (Arg), 75 Isoleucin (Ile), 150 Leucin (Leu). Bemerk at både 10 mM Phe og 10 mM Ile så vel som blandingen av aminosyrer øker SKCaFTs respons på en gitt Ca2+-konsentrasjon. Således viser disse data at tilstedeværelse av aminosyrer enten alene eller i kombinasjon øker den åpenbare sensitivitet for Ca2+ som tillater SKCaR å "føle" aminosyrer i nærvær av fysiologiske konsentrasjoner av Ca2+.Betydningen av disse data for organismer i vann står i markert motsetning til de nevnte i publiserte rapporter om rollene av humane CaRs aminosyrefølende evner. Figur 52 viser at SKCaR's maksimale evne til å føle aminosyrer er begrenset til et område av Ca2+ som er til stede både i ytre omgivelser i vann så vel som kroppsfluidene til forskjellige fisk. Basert på tidligere lokalisering av data for PVCR'er i fisk er de følgende viktige fysiologiske prosesser og applikasjoner ifølge foreliggende oppfinnelse: 1. Føling av aminosyrer i den proximale tarm og "pyloric caeca" hos fisk: PVCR til stede på den apicala overflate av tarmepitelceller kan respondere på aminosyrer så som tryptofan som en del av APS-Prosess II. Inntak av tryptofan i foret til fisk interagerer med tarm-PVCR for å forbedre utviklingen av unge anadrome fisk til å tolerere overføring til sjøvann. 2. I både voksne, unge og yngel-fisk kunne PVCR lokalisert til den apicale membran av mage- og tarmepitelceller "føle" tilstedeværelsen av aminosyrer produsert ved proteolyse av proteiner til aminosyrer. Denne mekanismen kunne anvendes til å informere både epitheliale og nevroendokrine celler i tarmen om tilstedeværelsen av næringsstoffer (proteiner) og utløse en serie responser omfattende vekst og differensiering av tarmepitheler så vel som deres medfølgende transportproteiner, sekresjon eller reabsorbsjon av ioner så som mavesyre. Det er antatt at det apicale PVCR også kan regulere sekresjonen av tarmhormoner så som cholecystokin (CCK) og andre. 3. PVCR som til stede i celler av neselamellene til fisk kan anvendes til å "lukte" både vannsaltinnhold (via Ca2+, Mg2+ og NaCI) og aminosyrer. Aminosyrer, Ca2+, Mg2+ og/eller NaCI kan anvendes som både attraktanter og for husing.Det vises til følgende referanser: Patentsøknad No. 09/687,373, med tittelen "Growing Marine Fish in Fresh Water," innlevert Oktober 12, 2000; Patentsøknad No. 09/687,476, med tittelen "Methods of Raising Pre-adult Anadrome Fish," innlevert Oktober 12, 2000; Patentsøknad No. 09/687,372, med tittelen " Methods of Raising Pre-adult Anadrome Fish," innlevert Oktober 12, 2000; ProvisionalPatent Application No. 60/240,392, med tittelen " Polyvalent Cation Sensing Receptor Proteins in Aquatic Spedes," innlevert Oktober 12, 2000; ProvisionalPatent Application No. 60/240,003, med tittelen "Polyvalent Cation Sensing Receptor Proteins in Aquatic Species," innlevert Oktober 12, 2000; Patentsøknad No. 09/162,021, innlevert September 28,1998, Internasjonal PCT application No. PCT/US97/05031, innlevert mars 27,1997 og Application No. 08/622,738 innlevert mars 27,1996, alle med tittelen," Polycation Sensing Receptor in Aquatic Species and Methods of Use Thereof".
Claims
1. Fremgangsmåte for å forbedre oppdrett av pre-voksen anadrome fisk, hvor den pre-voksne anadrome fisk blir holdt i ferskvann før overføring til sjøvann, omfattende: a) tilsetning av minst én polyvalent kation-følende reseptor (PVCR)-modulator til ferskvannet i en mengde tilstrekkelig til å modulere ekspresjon og/eller sensitivitet av minst én PVCR i nevnte pre-voksen anadrome fisk; og b) tilsetning av for for fiskekonsum til ferskvannet, hvor fåret inneholder et middel som bidrar til et betydelig øket nivå av nevnte PVCR-modulator i serum av den pre-voksne anadrome fisk av nevnte pre-voksen anadrome fisk konsumerer foret.2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor den pre-voksne anadrome fisken er laks.3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, hvor PVCR-modulatoren ifølge trinn a) er valgt fra gruppen bestående av et divalent kation, et trivalent kation, et aminoglykosid, et organisk polykation, en aminosyre, en type 1 kalsimimetika, en type II kalsimimetika, 1,25 dihydroksyvitamin D, et cytokin, og makrofag kjemotaktisk peptid-1 eller en kombinasjon derav.4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, hvor midlet inneholdt i foret er NaCI.5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, hvor NaCI er tilstede i en mengde på minst ca. 1 vekt-%.6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, hvor PVCR-modulatoren i trinn a) omfatter kalsium og magnesium.7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, hvor tilsetning av minst én PVCR-modulator til ferskvannet omfatter tilsetning av kalsium til ferskvannet i en mengde som er tilstrekkelig for å bringe kalsiumkonsentrasjonen opp til mellom omtrent 2,0 mM og omtrent 10,0 mM, og tilsetning av magnesium til ferskvannet i en mengde tilstrekkelig for å bringe magnesiumkonsentrasjonen opp til mellom ca. 0,5 mM og ca. 10,0 mM.8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, hvor øket ekspresjon og/eller sensitivitet til minst én PVCR blir holdt inntil den pre-voksne anadrome fisk blir overført til sjøvann.9. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, hvor foret også inkluderer minst én PVCR-modulator.10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, hvor nevnte PVCR-modulator inneholdt i foret omfatter en aminosyre.11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, hvor aminosyren er tryptofan i en mengde mellom ca. 1 gm/kg og ca. 10 gm/kg.12. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 11, ytterligere omfattende å eksponere den pre-voksne anadrome fisk til en fotoperiode.13. Anvendelse av et fdr for konsumpsjon av anadrome fisk i ferskvann for anvendelse i fremgangsmåten ifølge krav 1, hvor foret omfatter: a) én eller flere kilder av ernæring; b) en mengde av NaCI mellom ca. 10.000 mg/kg og ca. 100.000 mg/kg;og c) minst én PVCR-modulator;hvor foret modulerer ekspresjon og sensitivitet av minst én PVCR.14. Anvendelse ifølge krav 13, hvor PVCR-modulatoren omfatter en aminosyre.15. Anvendelse ifølge krav 14, hvor aminosyren omfatter tryptofan i en mengde mellom ca. 1 gm/kg og ca. 10 gm/kg.
Drawings

Priority

2000.10.12 US 6873722000.10.12 US 6874762000.10.12 US 687477

Patent classes

IPC classesA01K 61/00A23K 1/18

Citations

No publications found

Applicants, owners and inventors

Owners
MariCal Inc
400 Commercial Street ME04101 PORTLAND USInventors
William H Harris Jr
79 Bramhall Street, Apartment 6 B US
David R Russell
Jordan Springs Road ME04002 ALFRED US
Jacqueline Nearing
346 Mill Road ME04097 NORTH YARMOUTH, US
Marlies Betka
Glenwood Avenue US

Agent

BRYN AARFLOT AS
BRYN AARFLOT AS

Org. number: 979993269

Name and address are automatically synchronized with the Brønnøysund Register Centre.

Open in The Brønnøysund Register Centre
Stortingsgata 8 0161 OSLO NO (OSLO Municipality, Oslo county)
Org. number: 979993269
Reference: 107712/HNY/HER

Status history

Payment history

Oppositions and appeals

No oppositions or appeals

Administrative limitation

No administrative limitation

Liens and licences

No liens or licenses registered

Gazette entries

No Gazette entries foundOnly events from 2024.03.04 and onwards are shown.