Farmasøytiske og nutrasøytiske produkter som innbefatter minst en forbindelse innenfor vitamin K2...
PT 20090692 (343923)
Key information
Title
Farmasøytiske og nutrasøytiske produkter som innbefatter minst en forbindelse innenfor vitamin K2 klassen og slike produkter for forebygging eller terapi av forstyrrelser relatert til ben, brusk og det kardiovaskulære systemet.
Application number
20090692
Case type
PCT-based
Status
08.07.2019 Patent meddelt (B1)
Filed
12.02.2009
Priority
14.07.2006 NO 20063291 and others
International application date
13.07.2007
International application number
PCT/EP2007/006241
Effective date
13.07.2007
Publicly available
01.04.2009
Applicant
PHARMACO AS (NO)
Owner
NATTOPHARMA AS (NO)
Inventor
Jo Klaveness (NO) et al.
Granted
08.07.2019
Patent number
343923
Expiry date
13.07.2027
Abstract and drawing
Disclaimer: This text has been machine-scanned and may contain errors – please refer to "Publications" for legally binding content.
Et farmasøytisk og nutrasøytisk produkt er tilveiebrakt som innbefatter vitamin K2 eller en forbindelse innenfor vitamin K2 klassen av forbindelser, eventuelt og fortrinnsvis i kombinasjon med en eller flere flerumettede fettsyrer, enten i renset form eller som en marin olje (dvs. fiskeog/eller krillolje). Også tilveiebrakt er anvendelsen av vitamin K2 eller en forbindelse innenfor vitamin K2 klassen av forbindelser, fortrinnsvis i kombinasjon med en eller flere flerumettede fettsyrer, enten i renset form eller som en marin olje, ved behandling eller profylakse av forstyrrelser relatert til ben, brusk og det kardiovaskulære systemet. Foretrukne forbindelser innenfor vitamin K2 klassen av forbindelser er MK-7, MK-8, MK-9 og MK-10, særlig MK-7 eller MK-9. Den marine oljen er foretrukket krillolje eller fiskeolje.
Publications
B1A
Checking availability of the latest published version...
Documents
ExpandDownload files (31)
Date
Date
Doc. No.
Process
Case number
In/Out
Journal description
To/from
04.06.2026
19-01
Saksbehandling
20090692(343923)
UT
PT Varsel om betaling av årsavgift for år 4 + (3352) (PT20090692)
02.06.2025
18-01
Saksbehandling
20090692(343923)
UT
PT Varsel om betaling av årsavgift for år 4 + (3352) (PT20090692)
11.06.2024
17-01
Saksbehandling
20090692(343923)
UT
PT Varsel om betaling av årsavgift for år 4 + (3352) (PT20090692)
06.06.2023
16-01
Saksbehandling
20090692(343923)
UT
PT Varsel om betaling av årsavgift for år 4 + (3352) (PT20090692)
10.01.2023
03-01
Overdragelse av søknad/rettighet
2022/19295
UT
GH Forespørsel
Heikki Lahti
21.12.2022
02-04
Overdragelse av søknad/rettighet
2022/19295
INN
GH 2022_19295_Merger_NattoPharma_Announcements - The Brønnøysund Register Centre
Heikki Lahti
21.12.2022
02-03
Overdragelse av søknad/rettighet
2022/19295
INN
GH 2022_19295_Key information from the Unit Register_PharmaCo_25 I 2018 - Brønnøysund Registers
Heikki Lahti
21.12.2022
02-02
Overdragelse av søknad/rettighet
2022/19295
INN
GH 2022_19295_Announcements - The Brønnøysund Register Centre_Kaydence Pharma
Heikki Lahti
21.12.2022
02-01
Overdragelse av søknad/rettighet
2022/19295
INN
GH 2022_19295_20191129 - Kaydence Pharma AS Certificate of Registration
Patent - Reminder of first annual fee (2009.05.14)
11.05.2009
05-02
Saksbehandling
20090692
INN
Fullmakt/Erklæring søkers rett til oppfinnelse
11.05.2009
05-01
Saksbehandling
20090692
INN
Korrespondanse (hoved dok)
01.04.2009
02-05
Saksbehandling
20090692
INN
Sammendrag
01.04.2009
02-04
Saksbehandling
20090692
INN
Patenttegninger
01.04.2009
02-03
Saksbehandling
20090692
INN
Krav
01.04.2009
02-02
Saksbehandling
20090692
INN
Beskrivelse
01.04.2009
02-01
Saksbehandling
20090692
INN
Korrespondanse (hoved dok)
12.02.2009
01-03
Saksbehandling
20090692
INN
Tilleggsskjema Prioritetskrav
12.02.2009
01-02
Saksbehandling
20090692
INN
Tilleggsskjema Oppfinnere/Designere
12.02.2009
01-01
Saksbehandling
20090692
INN
Søknadsskjema PT (PT Form)
Description, claims and drawings
Disclaimer: This text has been machine-scanned and may contain errors – please refer to "Publications" for legally binding content.Description
Foreliggende oppfinnelse angår farmasøytiske og nutrasøytiske produkter som innbefatter minst en forbindelse innenfor vitamin K2 klassen av forbindelser, i kombinasjon med en eller flere av en polyumettet fettsyre, fiskeolje og krillolje, og deres anvendelse ved behandling eller profylakse av forstyrrelser relatert til ben, brusk og det kardivaskulære systemet. Særlig angår oppfinnelsen også anvendelsen av slike produkter ved behandling og/eller hindring av osteroporose, aterosklerose og osteoartritt.Vitamin K2 er en gruppe av forbindelser kalt menaquinoner ("MK") som alle er 2-metyl-3-all-trans-polyprenylerte-1,4-naftoquinoner som har følgende strukturformel:De kjemiske forskjellene mellom de forskjellige MKene relateres til antallet isoprenenheter i sidekjeden. De forskjellige MKene blir normalt referert til som klasse MK-2, MK-3, MK-4, MK-6 osv. Antallet refererer til antallet isoprenenheter (n=2, n=3, n=4, n=6 ...).Begrepet vitamin K2 refererer til den naturlig forekommende blandingen av de forskjellige MK substansene. MK-2 til og med MK-13 er naturlig tilstede i dyre- og menneskevev. Diettkilder av vitamin K2 er typisk fermenterte produkter, spesielt ost og ostemasse. Også visse flatfisker og ål kan inneholde noe vitamin K2. "Natto", som produseres fra fermenterte soyabønner er en populær kilde for vitamin K2 som et "sunnhetsprodukt" i Japan. Det daglige inntaket av vitamin K2 kan variere over et bredt spekter og kan typiske være fra noen få μg til flere milligrams; generelt under 50 μg. Vitamin K2 angis å ha flere fordelaktige effekter for menneskehelse, først og fremst relatert til det kardiovaskulære systemet og benmetabolisme.Osteoporose er en medisinsk tilstand kjennetegnet ved redusert benmasse og forandringer i mikroarkitekturen av benet. Det er estimert at mer enn 200 millioner kvinner har osteoporose verden over. Osteoporose og osteoporosefrakturer er økende over hele verden først og fremst som et resultat av den rasktvoksende eldre populasjonen.
Behandling av osteoporose i dag inkluderer typisk hormonbehandling, inntak av kalsium og vitamin D og legemiddelbehandling ved anvendelse av bisfosfonater.Aterosklerose er en kardiovaskulær sykdom som kan berøre arteriene av flere vitale organer som inkluderer hjerne, hjerte, nyrer så vel som armer og ben. I de fleste vestlige land er aterosklerose en ledende årsak til død. Antallet dødsfall fra aterosklerose er ca. to ganger antallet dødsfall fra alle kreftsykdommer tilsammen. Aterosklerose er en sakte, progressiv sykdom som kan starte så tidlig som i barndommen. Ved aterosklerose mister arteriene deres elastisitet og blir harde. Det er flere tilstander assosiert med utvikling og progresjon av sykdommen som inkluderer risikofaktorer som fedme, diabetes, hypertensjon og røyking. Mens aterosklerose rent medisinsk er generelt definert som en inflammatorisk sykdom i arterial tunica intima, blir arteriosklerose mer bredt definert og innbefatter også andre former for vaskulær sykdom slik som Mønckebergs sklerose i media.Artrose, inflammatorisk artritt, reumatoid artritt og osteoartritt er sykdommer i brusk og de er kjennetegnet ved artikulær degenerering. Patologisk er det en forandring i bruskstrukturen. Disse sykdommene berører leddene og sykdom kan ofte enkelt diagnostiseres med røntgen. Flere typer legemidler blir i dag anvendt for behandling av disse sykdommene. Disse inkluderer enkle analgesiske midler, NSAIDer, COX 2 inhibitorer, kortikosteroider og glukosamin.I løpet av de siste årene beskriver flere publikasjoner en positiv effekt når det gjelder inntak av vitamin K2 på osteoporose; se for eksempel W. Sakamoto et al. i Osteoporosis International 16, 1604-1610 (2005); M. Kaneki i Clinical Calcium 15, 605-610 (2005); J. Iwamoto et al. i Current Farmasøytisk Design 10, 2557-2576 (2004); K. Nakayama i Horumon to Rinsho 52, 339-349 (2004); S. Shiomi et al. i American Journal of Gastroenterology 97, 978-981 (2002) og T. Hosoi i Bone (Osaka) 14, 95-97 (2000).Det er flere publikasjoner relatert til anvendelsen av vitamin K2 eller Natto for behandling av aterosklerose eller tilsvarende tilstander; se for eksempel Y. Ozawa i Gifu Daigaku lgakubu 50, 20-26 (2002); L. J. Schurgers et al i Zeitschrift für Kardiologie 90 (Suppl. 3), iii57-iii63 (2001); Y. Seyama i Clinical Calcium 9, 873-878 (1999); H. Kawashima et al. i Jap. Journal of Pharmacology 75, 135-143 (1997) og J. M.Geleijnse et al. i the Journal of Nutrition 134, 3100-3105 (2004).
I en nylig publikasjon rapporterte T. Neoqi et al. (Arthritis & Rheumatism 54, 1255-1261 (2006)) at lave nivåer av serum vitamin K er assosiert med en økt hyppighet av osteoartritt.Polyumettede fettsyrer, eller PUFAer, er langkjedede fettsyrer som inneholder to eller flere dobbelbindinger. Interesse for dem oppstår fra deres potentiale innenfor terapeutiske anvendelser, og mat- og ernæringsanvendelser. De forekommer i dyr, plante, alger, sopp og bakterier og blir omfattende funnet i mange lipidforbindelser slike som membraner, lagringsoljer, glykolipider, fosfolipider, sfingolipider og lipoproteiner. De fremstilles kommersielt fra valgte frøplanter og noen marine kilder.PUFAer grupperes i to serier på basis av posisjonen til den terminale dobbelbindingen være 3C eller 6C fra det terminale karbonatomet til fettsyrekjeden. Noen eksempler er: 3-serie PUFA, også referert til som omega-3 eller (n-3) PUFA, inkluderer omega-3 fettsyreanriket diettoljer, slik som fiskeolje, krillolje, eikosapentensyre (EPA), dokosaheksensyre (DHA), linolensyre (LA), og alfa-linolensyre (ALA).6-serie PUFA inkluderer gamma-linolensyre (GLA) og arakidonsyre (AA).Krill er en gruppe av rekelignende marine dyr som lever i Arktis og Antarktisområdene. Størrelsen på krill er normalt mellom 5 og 50 mm. Det er flere arter av krill. De arktiske artene inkluderer T. inermis, T. rushii, T. longicauda og M. norvegia, mens Antarktisartene inkluderer E. superba og E. crystallorphias. Krill og krillrelaterte produkter har blitt foreslått som komponenter i fór for fisk; se for eksempel KR 2005031319, KR 2004087618, JP 2003070426, US 6153251 , EP 729708, SU 1784152, JP 05030923, JP 0465454 og JP 61274653.Videre blir krill og krillbaserte produkter anvendt som fiskeagn (se for eksempel CN 1820626), i kombinasjon med konjugert linolensyre for behandling og profylakse av sykdommer (US 2006078625), som additiver for å inhibere oksidasjon av lipider (WO 2005075613), som gjødningsstoffer (CN 1502589), som mat (JP 2004065152 og WO 2003/003857), for behandling av kardiovaskulære sykdommer, artritt, hudkreft, diabetes og premenstruelt syndrom (WO 2002/102394), som en kilde for enzym for behandling av acne og andre sykdommer (US 5958406, US 5945102, US 6030612, WO 96/24371 og WO 93/24142) og som en kilde for multifunksjonelle enzymer ( US 6030612).Krillenzymer har ytterligere blitt foreslått for behandling av trombose (WO 95/33471) og anvendes for fremstilling av sammensetninger for dental anvendelse (WO 95/33470).
Krill eller krillbaserte produkter er også foreslått som fungicider (JP 07033619), som antidiabetiske midler (JP 04042369) og proteiner fra krill har blitt foreslått for fremstilling av (JP 01137952). Andre patentdokumenter relatert til krill og krillkomponenter er: tannpasta som innbefatter krillfettsyrer (JP 2568833), kosmetikk som inneholder proteaser ekstrahert fra krill for hudrensning (JP 63218610), antiinflammatorisk proteinase fra krill (JP 61068419), tromboseoppløsningsmiddel (EP 170115), enzym sammensetning som digesjonpromoter (WO 85/04809), kitinpreparat (PL 114387), karotenoidpreparater (PL 113328, krabbekjøttlignende mat (JP 57125677, JP 57079863 og JP 67050848), antihypertensive midler (JP 54119011) og krillbasert mat (JP 60046947, JP 61023987 og JP 55040218).Det totale lipidinnholdet av krill varierer fra art til art. Det er også variasjoner når det gjelder totalt lipidinnhold i løpet av året. Lipidsammensetningen til krill varierer også for hver art i løpet av året. Den totale lipidmengden i krill er typisk mellom 5 og 60%. Prosentandel av totale triglyceroler og voksestere av totalt lipid i krill kan variere over et bredt område; hver fra tilnærmet null til 70%. I tillegg til triglyceroler og voksestere innbefatter krillipid heretter krillolje, fosfolipider, steroler, frie fettsyrer og fettalkoholer. Typiske fosfolipider inkluderer forbindelser som fosfatidylkoliner og fosfatidylethanolaminer. Krilloljen kan være i form av råolje oppnådd fra krill eller i form av renset eller modifisert olje. Umettede forbindelser og polyumettede forbindelser danner en stor andel av fettforbindelsene i krillolje. Hovedfettsyrebestanddelene i krillolje er følgende fettsyrer: 14 : 0, 16 : 0, 16 : 1 (n-7), 18 : 0, 18 : 1, 18 : 1 (n-9), 18 : 1 (n-7), 18 : 2 15 (n-6), 18 : 3 (n-3), 18 : 4 (n-3), 20 : 1 (n-9), 20 : 5 (n-3), 22 : 1 (n-11), 22 : 6 (n-3).For referanser til sammensetning av krillolje, se for eksempel: S. Falk-Perdersen et al. i Can. J. Fisk Aquat. Sci.57 ( Suppl.3) 178-191 (2000), F. Alonzo et al. i Marine Ecology: Progress Series 296, 65-79 (2005), N. Kusumoto et al. i J. Oleo Science 53, 45- 51 (2004) og referanser heri.Selv om det er flere farmasøytiske produkter på markedet for behandling av osteoporose og kardiovaskulær sykdom, eksisterer det fremdeles et trengende behov for alternative tilnærminger.Det har nå blitt overraskende funnet at vitamin K2 og polyumettede fettsyrer (PUFAer) kan formuleres sammen i en stabil formulering med lang lagringstid.
Således, i et første aspekt, tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et farmasøytisk eller nutrasøytisk produkt for oral administrering som omfatter minst en forbindelse innenfor vitamin K2 klassen av forbindelser bestående av MK-7, MK-8, MK-9 og MK-10, i kombinasjon med minst en av en polyumettet fettsyre, enten renset eller i form av en marin olje, hvori nevnte produkt er en tablettformulering eller en kapselformulering.I en utførelsesform er det ovennevnte produktet for profylakse eller terapeutisk behandling av minst en av aterosklerose, arteriosklerose, osteoporose, osteoartritt eller en inflammatorisk eller degenerativ sykdom omfattende brusk.I en utførelsesform er nevnte polyumettede fettsyre i det ovennevnte produkt, i form av fiskeolje eller krillolje eller hvori nevnte polyumettede fettsyre er en n-3 polyumettet fettsyre, foretrukket EPA eller DHA eller en blanding derav, eller hvor nevnte fettsyre er en kombinasjon av EPA og DHA i form av deres triglycerider eller etylestere.I et andre aspekt, tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et farmasøytisk eller nutrasøytisk produkt, som omfatter minst en forbindelse innenfor vitamin K2 klassen av forbindelser som er valgt fra MK-7, MK-8, MK-9 og MK-10, for forebygging eller terapi av minst en av kardiovaskulær-, ben- og bruskrelaterte sykdommer eller forstyrrelser hos mennesker og dyr, og ytterligere omfatter minst en av en polyumettet fettsyre, enten renset eller i form av en marin olje hvori vitamin K2 forbindelsen administreres i en dosering i området fra 5-50 μg per dag.I en utførelsesform er nevnte polyumettede fettsyre i produktet for anvendelse ifølge oppfinnelsens andre aspekt i form av fiskeolje eller krillolje eller hvori nevnte polyumettede fettsyre er en n-3 polyumettet fettsyre, foretrukket EPA eller DHA eller en blanding derav, eller hvor nevnte fettsyre er en kombinasjon av EPA og DHA i form av deres triglycerider eller etylestere.Disse og andre aspekter ved foreliggende oppfinnelse vil bli diskutert mer i detalj i følgende detaljerte beskrivelse og eksempler.Det ble også funnet at vitamin K2, og særlig MK-7, ikke motvirker antikoagulanteffekten til marine oljer eller n-3 PUFA.Det ble videre funnet at de høyere menaquinonene, særlig MK-7 og høyere, motvirker potentielle arteriekalsifiserings-induserende effekter til marine oljer.
Det ble ytterligere funnet at høyere menaquinoner, særlig MK-7 og høyere, motvirker potentielt negative aspekter ved marine oljer på benhelse.Det ble også videre funnet at høyere menaquinoner, særlig MK-7 og høyere, motvirker potentielt negative aspekter ved marine oljer på bruskhelse.Det ble videre funnet, i cellekulturstudier, at MK-7 ble tatt bedre opp enn andre K vitaminer. MK-8 og MK-9 ble tatt opp i noe mindre grad, men ved et sammenlignbart nivå, mens MK-4 og vitamin K1 ble tatt opp i langt mindre grad.Det ble videre funnet, i cellekulturstudier, at de langkjedede menaquinonene, særlig MK-8 og MK-9, mindre trolig vil interferere med oral antikoagulantbehandling i forhold til andre former av vitamin K.Figur 1 viser det endogene trombinpotentialet (ETP), som reflekterer den totale trombin aktiviteten i løpet av koagulering. Karboksylerte og ikke-karboksylerte matriks GIaprotein (MGP) arter ble overvåket ved anvendelse av sandwich ELISAer basert på konformasjonsspesifikke antistoffer med normalt oppsamlet plasma som en referanse. Forandringen i MGP 15 karboksylering var signifikant etter en måned, men signifikans forsvant i løpet av måneder 3 og 4. Se eksperiment 2 nedenfor.Figur 2 viser i det samme eksperimentet som i Figur 1 karboksylerte og ikkekarboksylerte osteokalsinarter i serum ved anvendelse av konformasjonsspesifikke osteokalsinkit. Forandringen i osteokalsinkarboksylering var signifikant etter en måned, men signifikans forsvant i løpet av måneder 3 og 4. Se eksperiment 3 nedenfor.Figur 3 viser den eksepsjonelle stabiliteten til MK-7 løst i fiskeolje og krillolje. Prøver ble fremstilt i forseglede glassflasker og holdt i mørke ved romtemperatur, 40ºC og 100ºC, respektivt. Ved regulære tidsperioder ble prøver tatt og analysert for deres MK-7 innhold. Ikke noe tap av MK-7 ble observert, selv etter 2 uker ved 100ºC. Se Eksperiment 4 nedenfor.Figur 4 viser stabiliteten til vitaminer K1, MK-4, MK-7, MK-8 og MK-9 i tre cellekultur medier (anvendt for dyrking av de tre forskjellige celletypene beskrevet nedenfor, respektivt) uten celler tilstede. Se Eksperiment 5 nedenfor.
Figurer 5A-C viser doseresponskurver for cellulært vitamin K opptak i tre forskjellige celletyper; celler ble dyrket til 80% konfluens, hvoretter vitamin K (dvs. K1, MK-4, MK-7, MK-8 og MK-9) ble tilsatt i forskjellige konsentrasjoner. Figur 5D viser et plot av MK-7 opptaket i tre celletyper ved samme skala. Se Eksperiment 6 nedenfor.Figurer 6A-C viser det cellulære opptaket av vitaminer K1, MK-4, MK-7, MK-8 og MK-9 i tre forskjellige celletyper som en funksjon av tid; celler ble dyrket i dyrkningsmediet beskrevet i Eksperiment 5. I alle tilfeller ble en blanding av disse K vitaminene tilsatt til cellene etter at de hadde blitt dyrket til 80% konfluens. Se Eksperiment 7 nedenfor.Figurer 7A-C viser omfanget hvorved warfarin blir forbigått av de forskjellige formene av vitamin K (som måles med K epoksiddannelse). Dess mer KO som dannes, dess høyere omfang av forbigåelse via enzymet DT diaforase. Se Eksperiment 8.Figurer 8A-C viser omfanget hvorved de forskjellige formene av vitamin K blir anvendt under fravær av warfarin, men under betingelser med cellesulting. Dess mer KO som dannes, dess færre vitamin K typer blir resirkulert. Se Eksperiment 9 nedenfor.Begrepet "polyumettet fettsyre" slik det anvendes heri, refererer til en hvilken som helst polyumettet fettsyre, om den er i form av et triglycerid, en fysiologisk akseptabel ester, en fri fettsyre eller et fysiologisk akseptabelt salt av en polyumettet fettsyre. Mer spesifikt blir begrepet anvendt for å indikere omega-3 fettsyrer, og omega-3 fettsyreanrikede diettoljer slike som fiskeolje og krillolje. I litteraturen er omega-3 fettsyrer også kjente som (n-3) polyumettede fettsyrer eller n-3 PUFA.Begrepet "krillolje" slik det anvendes heri, er ment å indikere alle lipofile komponenter i krill og kan være råkrillolje, renset krillolje, forbindelser fra krillolje og derivater av komponenter fra krillolje.Slik det anvendes heri, blir fiskeolje og krillolje kollektivt betegnet som "marine oljer".Begrepet "vitamin K2", som anvendt heri, refererer til naturlig forekommende menaquinoner (MKer) eller blandinger derav.Begrepet "forbindelse innenfor vitamin K2 klassen av forbindelser", som anvendt heri, refererer til en enkel menaquinon (MK) forbindelse.
Begrepet "først og fremst MK-7" slik det anvendes heri, refererer til sammensetninger hvori minst 90% av alle vitamin K2 forbindelser i sammensetningen, i henhold til HPLC analyse, er MK-7.Foreliggende oppfinnelse er primært basert på visse overraskende funn i i-dybdestudier når det gjelder de farmakologiske egenskapene til vitamin K2, og særlig de høyere menaquinonene (MK-7, MK-8, MK-9 og MK-10), og kombinasjoner av disse forbindelser med PUFAer, i ren form eller i form av fiskeolje eller krillolje. Disse funnene tilveiebringer nye muligheter og utfordringer for forbedrede produkter innenfor det farmasøytiske og nutrasøytiske feltet relatert til profylakse eller behandling av visse kardiovaskulærrelaterte, benrelaterte og bruskrelaterte forstyrrelser og, mer generelt, resulterer i fordelaktige effekter på helsen til mennesker og dyr.Disse funnene vil bli diskutert mer i detalj nedenfor.Flere helseaspekter ved n-3 PUFA har blitt rapportert som inkluderer en markert fordelaktig effekt på kardiovaskulær sykdom. Slik det har blitt gjennomgått av Van Schoonbeek et al. (Journal of Nutrition 133, 657-660 (2003)), er de fordelaktige effektene til n-3 PUFA og marine oljer basert på multiple mekanismer som inkluderer reduksjonen av blodplateaktivitet, en mer fordelaktig blodlipidprofil og en reduksjon i blodkoagulerbarhet.Hypokoagulanteffekten til marin olje og n-3 PUFA skyldes først og fremst en reduksjon av den hepatiske vitamin K statusen og en samtidig reduksjon av vitamin K-avhengige proppefaktorer II, VII, IX, og X, som fører til et redusert trombindannende potentiale. C.M.A. Nieuwenhuys et al. konkluderte at "Prolonged administration of n-3 but not n-6 PUFAs can lead to a hypocoagulable state of plasma through a reduced capacity of vitamin K-dependent thrombin generation with unchanged thrombin inactivation by antithrombin". En spesifikk inhibering av vitamin K-avhengig proppefaktorsyntese ble også rapportert av C. Leray et al. (Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 22, 459-463 (2001)). Dette er i overensstemmelse med observasjonen til L.J. Schurgers et al. (Journal of Lipid Research 43, 878-884 (2002)), at noen diettoljer kan interferere med vitamin K absorpsjon og metabolisme hos friske frivillige. Direkte bevis for interferens med vitamin K metabolisme ble gitt av C.M.A. Nieuwenhuys et al.(Thrombosis Research 104, 137-147 (2001)) som viser at fiskeolje og n-3 PUFAer reduserte vitamin K nivåene i leveren (dvs. stedet hvor proppefaktorene syntetiseres). Videre viste M. Andriamampandry et al. (Medical Sciences 321 , 415-421 (1998)) at
den milde antikoagulanteffekten til fiskeolje ble fullstendig reversert med en svak økning av vitamin K1 inntak.Det har nå overraskende blitt funnet at vitamin K2, særlig MK-7, ikke reverserer den fordelaktige effekten til fiskolje. I doseringer typisk mellom 1 og 10 μg/dag påvirket MK-7 ikke det ekstrinsiske trombinpotentialet (ETP), som er det mest sensitive målet for tromboserisiko. Således kombinerer blandinger av vitamin K2 med n-3 PUFA eller marin olje de fordelaktige effektene av begge typer forbindelser og virket til og med synergistisk i dyremodeller og hos frivillige mennesker. I doser på 100 μg MK-7 per dag og høyere ble den ETP-reduserende effekten til marine oljer fullstendig reversert. Det skal noteres at disse dosene av MK-7 er relatert til et marinoljeinntak på 5 g per dag. Ved høyere fisk- eller krilloljekonsumpsjon er også dosen som kreves for interferens med ETP høyere.Selv om en dårlig vitamin K status kan ha en mild antikoagulant (dvs. antitrombotisk) effekt, er vitamin K påkrevd i et annet aspekt av vaskulær helse. Matriks Gla-protein (MGP) er et vitamin K-avhengig protein syntetisert i den arteriale karveggen. Den aktiveres av vitamin K-avhengig karboksylering og i dens karboksylerte form virker den som en sterk inhibitor av vaskulær kalsifisering. Ved anvendelse av konformasjonsspesifikke antistoffer, ble det demonstrert av Schurgers et al. (Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 25, 1629-1633 (2005)) at aterosklerose og vaskulær kalsifisering er nært assosiert med dårlig vitamin K status i karveggen, og fant i et undersøkende klinisk forsøk L.A.J. L. M. Braam et al. (Thrombosis & Haemostasis 91 , 373-380 (2004)) at høy dose vitamin K-supplementering (1 mg/dag) hadde store fordeler for vaskulær elastisitet. Vi har funnet at marin olje og n-3 PUFA ikke bare fordelaktig reduserer produksjonen av vitamin K-avhengige proteiner i leveren (proppefaktorene), men reduserer også vitamin K- statusen til ekstrahepatisk vev og således reduserer aktiveringen (ved glutamatkarboksylering) av ekstra-hepatiske vitamin K-avhengige proteiner som inkluderer osteokalcin og matriks Gla-protein (MGP). Dette er en uventet bivirkning fra marine oljer og n-3 PUFA med potentielt skadelig utkomme for kardiovaskulær helse, for benhelse og for utvikling av brusksykdommer. Den reduserte karboksyleringen til den vaskulære kalsifiseringsinhibitoren MGP er for eksempel en hovedrisikofaktor for vaskulær kalsifisering, hypertensjon, myokardiskt infarkt og kardiovaskulær død.Det har nå overraskende blitt funnet at høyere menaquinoner, først og fremst MK-7, i doseringer på mellom 1 og 10 μg/dag ikke motvirker den milde antikoagulanteffekten til
marine oljer (som måles med ETP), men samtidig stimulerer de effektivt MGP karboksylering til nivåer tilsvarende eller til og med høyere enn nivået hos subjekter som ikke anvender marin olje. Dette er beskrevet i Eksperiment 2 nedenfor. Således er MK-7 en essensiell ingrediens for å ha maksimal fordel av marin olje og n-3 PUFA-inneholdende mat og matsupplementer direkte anvendt for kardiovaskulær helse.Marine oljer og n-3 PUFA har også blitt funnet å ha fordelaktige effekter på benhelse. I eksperimentelle dyremodeller reduserte slike oljer markert bentapet i ovariekterte mus og matbegrensede rotter (D. Sun et al. Journal of Bone and Mineral Research 18, 1206-1216 (2003); Sun et al. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 68, 2613-2615 (2004)). Det har blitt rapportert av mange forfattere at lavt vitamin K inntak, dårlig vitamin K status og svekket osteokalcinkarboksylering er risikofaktorer for utvikling og progresjon av osteoporose. Se for eksempel: S. L. Booth et al. American Journal of Clinical Nutrition 77, 512-516 (2003), P. Szulc et al. Journal of Clinical Investigation 91 , 1769-1774 (1993), C. Vermeer et al. European Journal of Nutrition 43, 325-325 (2004). Det har også blitt demonstrert at økt inntak av vitamin K resulterer i en redusert grad av bentap hos postmenopausale kvinner (L.A.J. L.M. Braam et al. Calcified Tissue International 73, 21-26 (2003), M. Shiraki et al. Journal of Bone and Mineral Research 15, 515-521 (2000)). Doseringene anvendt i disse studiene varierer mellom 1 mg/dag for K1 og 45 mg/dag for K2. I dette lys må den marinoljeinduserte reduksjonen av osteokalcinkarboksylering anses som en skadelig bivirkning som delvis ødelegger for fordelene ved marine olje for benhelse. Den rapporterte høye dosevitamin K behandlingen kan motvirke bivirkningen, men vil også annihilere den milde antikoagulanteffekten rapportert å være fordelaktig for kardiovaskulær sykdomshindring.Det har nå overraskende blitt funnet at de høyere menaquinonene, først og fremst MK-7, i doser varierende mellom 1 og 10 μg/dag ikke motvirket den milde antikoagulant effekten til marine oljer (som måles med ETP), men samtidig stimulerer effektivt osteokalcinkarboksylering til nivåer tilsvarende eller til og med over nivået hos subjekter som ikke anvender marin olje. Dette er beskrevet i Eksperiment 3 nedenfor. Således er MK-7 en essentiell ingrediens for å maksimere fordelen fra marin olje og n-3 PUFA-inneholdende mat og matsupplementer direkte anvendt for benhelse.Marine oljer og n-3 PUFA har også blitt funnet å motvirke degenerativ og inflammatorisk leddsykdom som observeres ved osteoartritt, reumatoid artritt og ankyloserende spondylititt. I cellekulturstudier ble det demonstrert at supplementering med n-3 PUFA, ikke n-6 PUFA, forårsaket en reduksjon i både degenerative og inflammatoriske
aspekter ved kondrocyttmetabolisme, mens det ikke hadde noen effekt på normal vevshomeostasis (CL. Curtis et al., Proc. Nutr. Soc.61 , 381-389 (2002)). Også populasjonsbaserte studier viser en positiv rolle til fiskeolje og n-3 PUFA for behandling av osteoartritt, reumatoid artritt og andre sykdommer vedrørende brusk (se for eksempel: L.G. Cleland et al., Drugs 63, 845-853 (2003) og M.J. James et al., Prostaglandins, Leukotriens and Essential Fatty Acids 68, 399-405 (2003)). Som beskrevet ovenfor, reduserte marine oljer og n-3 PUFA ikke bare produksjonen av vitamin K-avhengige proteiner i leveren (proppefaktorene), men reduserte også vitamin K-statusen til ekstrahepatiske vev og reduserte således aktiveringen (ved glutamatkarboksylering) av ekstrahepatiske vitamin K-avhengige proteiner som inkluderer osteokalcin og matriks Gla-protein (MGP). MGP er et av de mest forekommende proteinene syntetisert av brusk, og vitamin K er nødvendig for det aktivering ved glutamatkarboksylering. Dårlig MGP karboksylering har blitt assosiert med osteoartritt, reumatoid artritt og ankyloserende spondylititt. Helt klart er en fremgangsmåte nødvendig for motvirkning av den marinolje-induserte reduksjonen av vitamin K status i brusk.Det har nå overraskende blitt funnet at ernæringsrelevante doser av MK-7 motvirker potentielt negative aspekter ved marine oljer på bruskhelse. Det faktum at de høyere menaquinonene, først og fremst MK-7, i doseringer som varierer mellom 1 og 10 μg/dag, ikke motvirker den milde antikoagulanteffekten til marin olje (som måles ved ETP), men samtidig effektivt stimulerer både osteokalcinkarboksylering og MGP karboksylering til nivåer tilsvarende eller til og med over nivået hos subjekter som ikke anvender marin olje viser at MK-7 er i stand til å tilveiebringe optimal vitamin K status i ben, som inkluderer brusket i leddene i løpet av marine oljesupplementering. Således er MK-7 en essentiell ingrediens for å maksimere fordelen fra marine oljer og n-3 PUFA-inneholdende mat og matsupplementer direkte anvendt for bruskhelse.I en serie cellekultureksperimenter ble vitamin K opptake og metabolisme under forskjellige betingelser undersøkt. De følgende formene for vitamin K ble sammenlignet: Ki, MK-4, MK-7, MK-8 og MK-9. De ble testet i tre forskjellige celletyper: de vaskulære glattmuskelcellene, den osteoblastlignende MG-63 cellelinjen og den hepatocyttlignende HepG2 cellelinjen. I alle eksperimentene ble vitaminene anvendt som en blanding som inneholder 1 μmol/L av hvert vitamin.Det ble funnet at i alle cellene blir MK-7 tatt bedre opp enn andre K vitaminer. MK- 8 og MK-9 blir tatt opp i noe mindre grad, K1 og MK-4 langt mindre.
Det ble også funnet at under nærvær av antikoagulanten warfarin, ble det membranbundede enzymet VKOR blokkert og således kan vitamin K ikke resirkuleres. Etter bruk holdes den i den oksiderte formen (K-epoksid); mengdene epoksider representerer omfanget av bruken. Det ble funnet at langkjedede menaquinoner og særlig MK-9 ikke kan bli redusert, og således ikke anvendes som et koenzym for karboksylase under disse betingelsene. De mer vannløselige vitaminene K1 og MK-4 kan imidlertid anvende det cytoplasmiske enzymet DT-diaforase for reduksjon og interferere med oral antikoagulantbehandling. Derfor vil trolig langkjedede menaquinoner i mindre grad interferere med oral antikoagulantbehandling i forhold til andre former av vitamin K. Dette er et viktig sikkerhetsaspekt, og i overensstemmelse med dyreeksperimenter som har blitt publisert tidligere (Craciun, A.M., Groenen-van Dooren, M. M. C. L., Thijssen, H.H.W., Vermeer, C. (1998). Induction and prothrombin synthesis by K-vitamins compared in vitamin K-deficient and in brodifacoum- treated rats. Biochim. Biophys. Acta 1380, 75-81.Under fravær av warfarin og i rikt medium blir ingen epoksider dannet i det hele tatt. Hvis konsentrasjonen av fosterkalveserum i dyrkningsmediet reduseres, blir ernæringsstatusen til cellene underoptimal. Også under disse betingelsene ble MK-4 og K1 epoksidene først og fremst funnet. Konklusjonen nå er forskjellig i forhold til warfarin eksperimentet, imidlertid: de langkjedede menaquinonene anvendes fordelaktig og konkurrerer vellykket med K1 og MK-4 ved reduksjonsnivået ved VKOR. Derfor kan det konkluderes at langkjedede menaquinoner blir foretrukket anvendt ved gammakarboksylering av forskjellige proteiner. Dette er i overensstemmelse med tidligere publiserte cellefrie enzymkinetikkstudier som viser at Michaelis konstant (Km) for vitamin K reduseres med økende lengde av dens sidekjede (Buitenhuis, H. C, Soute, B.A.M., Vermeer, C. (1990). Comparison of the vitamins K1, K2 and K3 as cofactors for the hepatic vitamin K- dependent carboxylase. Biochim. Biophys. Acta 1034, 170-175).Det har nå blitt funnet at vitamin K2 og polyumettede fettsyrer kan formuleres sammen i en stabil formulering med lang lagringstid. For eksempel ble MK-7 blandet med fiskeolje eller krillolje i et bredt spekter av konsentrasjoner og disse sammensetningene holdt seg stabile under disse betingelsene i minst 2 uker ved 100ºC, i 6 måneder ved 40ºC og i 3 år ved romtemperatur. Detaljer når det gjelder disse studiene er vist i Eksperiment 4 nedenfor.Som definert ovenfor, refererer begrepet "polyumettet fettsyre" (PUFA) til en hvilken som helst PUFA i form av et triglycerid, en fysiologisk akseptabel ester, en fri fettsyre
eller et fysiologisk akseptabelt salt derav. Det beskrives sammensetninger av PUFAer og menaquinoner der PUFAer er kombinert først og fremst med MK-7. Videre beskrives sammensetning av PUFA og MK substanser hvori minst 95% av alle vitamin K2 forbindelser i sammensetningen, i henhold til HPLC analyse, er MK-7 med MK-6 som hovedvitamin K2 urenheten. Et typisk forhold mellom MK-7 og MK-6 i sammensetninger er i området mellom 90 til 10 og 95 til 5.Det beskrives sammensetninger av vitamin K2 eller en forbindelse innenfor vitamin K2 klassen av forbindelser og PUFA som innbefatter en PUFA valgt fra n-3 PUFAer. Mer foretrukket er n-3 PUFAer eikosapentaensyre (EPA) som er en 20:5 syre og dokosaheksensyre (DHA) som er en 22:6 syre.En enda mer foretrukket n-3 PUFA komponent i produkter beskrevet heri er en kombinasjon av EPA og DHA. Det mest foretrukne forholdet EPA : DHA er innenfor området 2:1 til 1.2.I den mest foretrukne sammensetningen er EPA og DHA i form av triglycerider eller etylestere.Formuleringene av produktene blir foretrukket administrert systematisk (for eksempel oralt eller parenteralt). Den mest foretrukne doseringsformen er en oral doseringsform; særlig kapsler og tabletter. Doseringen og administrasjonsruten vil avhenge av faktorer slik som alder og kjønn til individet, alvorligheten og typen forstyrrelse eller sykdom, og lignende, og kan enkelt bestemmes av fagmannen, vanligvis en lege, eller kan instruksjonsbrosjyren til produsenten følges som vanligvis ledsager produktet.Tabletter og kapsler kan fremstilles på vanlig måte slik det er kjent i litteraturen.Kapsler kan for eksempel være myke eller harde gelatinkapsler som i tillegg til vitamin K2 eller vitamin K2 forbindelser og polyumettet fettsyre innbefatter inaktive farmasøytisk akseptable komponenter, for eksempel stivelse. Tabletter kan, for eksempel, fremstilles ved direkte sammenpressing eller ved sammenpressing av granuler ved anvendelse av vanlige tablettmaskiner. Tabletter kan i tillegg til vitamin K2 eller vitamin K2 forbindelser og umettet fettsyre innbefatte farmasøytisk akseptable inaktive ingredienser godt kjente i litteraturen. Slike midler kan for eksempel være cellulosederivater og magnesiumstearat. Tabletter kan være belagte med et mageresistent belegg, for eksempel celluloseacetatftalat.
De orale doseringsformene, kapsler og tabletter, har hver en vekt 100 mg og 2 g.Mengden av vitamin K2 eller vitamin K2 forbindelser i hver tablett eller kapsel kan variere over et bredt spekter, avhengig blant annet av faktorer slik som alvorligheten og typen sykdom eller forstyrrelse, og tilstanden, kjønn og alder til pasienten. Mengden av vitamin K2 eller en vitamin K2 forbindelse innenfor vitamin K2 klassen av forbindelser i en tablett eller kapsel er typisk mellom 1 og 500 μg, selv om høyere mengder også er mulig. Foretrukne doseringer av vitamin K2, og først og fremst MK-7, er mellom 2 og 300 μg, mer foretrukket 5-50 μg, og mest foretrukket mellom 10-20 μg per dag.Mengden av umettet fettsyre i hver tablett eller kapsel kan også variere avhengig av typen umettet fettsyre, alvorligheten og typen sykdom, alder til pasienten og frekvens for administrasjon av tabletten eller kapselen. Mengden av umettet fettsyre i hver tablett eller kapsel er typisk mellom 300 og 1200 mg, foretrukket mellom 400 og 1000 mg, mest foretrukket mellom 500 og 900 mg.Data som angis viser at ved doseringer så høye som 10 μg per dag kan marin olje (ved en på ca.5 g) og MK-7 kombineres uten å interferere med den milde antikoagulanteffekten til marin olje. Således har MK-7 doseringer mellom ca.1 og minst 10 μg (helt klart dess høyere, dess bedre innenfor nevnte område) vist seg å være fordelaktige når det gjelder administrasjon til et menneske eller dyr. Doseringer så høye som 100 μg per dag er ikke mulig i forhold til formålet beskrevet her, på grunn av at disse doseringer ble funnet å motvirker effekten av warfarin, som er en enda sterkere inhibitor av blodproppefaktorkarboksylering enn n-3 PUFAs er. Se Schurgers, L.J., Teunissen, K.J. F., Hamulyak, K., Knapen, M.H.J., Vik, H., Vermeer, C. ”Vitamin K-containing dietary supplements: comparison of synthetic vitamin K1 and natto-derived menaquinone-7”. Blood 109 (2007) 3279-3283.Det vil være å forstå at doseringer av vitamin K og marine oljer også kan variere avhengig av variasjonen og kvaliteten av den marine oljen. Det anbefales derfor å anvende blandinger av marine oljer for å opprettholde et konstant forhold i sammensetningene.Det vil også være å forstå at vitamin K2 eller en forbindelse innenfor vitamin K2 klassen av forbindelser også kan formuleres separat og uavhengig fra en eller flere polyumettede fettsyrer (som inkluderer fiskeolje og krillolje), for eksempel i en farmasøytisk sammensetning eller en nutrasøytisk sammensetning (matsupplement). Egnede farmasøytiske sammensetningene og typiske doseringer er tilsvarende de som er
beskrevet ovenfor eller kjente for fagmannen. Egnede nutrasøytiske sammensetninger og typiske doseringer er for eksempel beskrevet i EP1153548.Sammensetningene som beskrevet heri kan eventuelt innbefatte andre farmasøytiske eller nutrasøytiske aktive komponenter; for eksempel vitaminer som vitamin D eller vitamin D derivater; aktive legemiddelforbindelser slike som bisfosfonater, typisk alendronat; eller kardiovaskulære legemidler, slike som ACE inhibitorer, for eksempel enalapril, angiotensin Il reseptorantagonister, for eksempel losartan, beta-blokkere, for eksempel propranolol, plasmalipidreduserende komponenter, slike som statiner, typisk simvastatin, og andre legemidler.Av de høyere menaquinonene, MK-7, MK-8, MK-9 og MK-10, er anvendelsen av MK-7 generelt den mest foretrukne, slik det vil forstås fra foreliggende beskrivelse. I tillegg foretrukket er MK-9, både på grunn av dens fordelaktige og lovende egenskaper og på grunn av dens tilgjengelighet siden den kan syntetiseres enkelt.Foreliggende oppfinnelse vil nå ytterligere bli beskrevet med referanse til følgende eksempler og eksperimentelt arbeid, som imidlertid ikke er konstruert som noen begrensning av oppfinnelsen i noe henseende.Eksempel 1. Kapsel som innbefatter EPA etylester, DHA etylester og MK-7 En olje som innbefatter 97% MK-7 og 3% MK-6 blandes med EPA etylester og DHA etylester. Alfa-tokoferol tilsettes, og den resulterende oljen filles i harde gelatin 5 kapsler.Hver kapsel inneholder:MK-7 97 μgMK-6 3 μgEPA etylester 463 mg;DHA etylester 375 mgAlfa-tokoferol 4 mgEksempel 2. Torskeleverolje som innbefatter vitamin K2Vitamin K2 løses i torskeleverolje (fra EPAX, Norge) og fylles i grønne glassflasker (250 ml) med en metallforsegling. Flaskene merkes "Vitamin K2 tran" for salg på det norske markedet.
En daglig dose (5ml) av dette produktet inneholder:Vitamin A: 250 μgVitamin D: 10 μgVitamin K2 (MK-7): 10 μgFiskeolje: 1,2 g, hvor DHA var 0,4 g og EPA var 0,6 g Alfa-tokoferol: 4 mgEksempel 3: Kapsel som innbefatter krillolje og MK-7.Krillolje som innbefatter polyumettede fettsyrer i triglycerolform, fosfolipider og andre naturlige komponenter (oppnådd fra Enzymotec, Israel) blandes med MK 7 og alfatokoferol. Den resulterende oljesammensetningen fylles i myke gel eller harde gelatinkapsler eller fremstilles som et oljeinneholdende granulat eller løsemiddel.Hver kapsel inneholder:MK-7 97 μgMK-6 3 μg krillolje 700 mgAlfa-tokoferol 4 mgEksempel 4: Krillolje som innbefatter Vitamin K2Vitamin K2 løses i krillolje og fylles i glassflasker (250 ml) med metallforsegling.Flaskene merkes "Krilloljetran med Vitamin K" for salg på det norske markedet eller "Krillolje som inkluderer vitamin K" for US og UK markedet. En daglig dose (5 ml krill olje) inneholder i området mellom 5 og 500 μg Vitamin K2Eksempel 5: Fiskefór som innbefatter krillolje og Vitamin K2Vitamin K2 (100 mg) løses i krillolje (1 kg). Fiskfór (fra Skretting AS, Stavanger, Norge) males opp. Det oppmalte fiskefóret (20 kg) blandes med krillolje som innbe fatter Vitamin K2 (1 kg) ved anvendelse av en blender. Vann tilsettes, og det delvis våte materialet siktes (3 mm) og tørkes i 24 timer ved 40ºC for å oppnå et fiskefórgranulat.Fórgranulatet inneholder ca.5% krillolje og 2-100 ppm vitamin K2.Eksempel 6: MK-8 kapslerEn olje som innbefatter MK-8 (HPCL analyse viser MK-8 høyere enn 70% av total Vitamin K2) fylles i myke gelatinkapsler. Hver kapsel inneholder 5 μg MK 8.
Eksempel 7: Kapsler som innbefatter EPA etylester, DHA etylester og blanding av MK-8, MK-9 og MK-10En olje som innbefatter en blanding av MK-8, MK-9, MK-10 blandes med EPA etylester og DHA etylester. Alfa-tokoferol tilsettes og den resulterende oljen fylles i harde gelatinkapsler.Hver kapsel inneholder:MK-8, MK-9, MK-1050 μgEPA etylester 463 mgDHA etylester 375 mgAlfa-tokoferol 4 mgEksempel 8: Torskeleverolje som innbefatter MK8MK8 (mer enn 65% i henhold til HPLC analyse) løses i torskeleverolje og fylles i grønne glassflasker (250 ml) med metallforsegling. Flaskene merkes med "Vitamin K2 tran" for salg på det norske markedet.En daglig dose (5 ml) av dette produkt inneholder:Vitamin A 250 μgVitamin D 10 μgMK-8 10 μgOmega-3 fettsyrer 1,2 g, hvor DHA var 0,6 g og EPA var 0,4 g dl-Alfa-tokoferylacetat 6 mgEksperiment 1: Karboksyleringsgraden av osteokalcin ved osteoartritt, osteopati og reumatoid artritt.Tre pasientgrupper ble rekruttert og sammenlignet med alders- og kjønnsmatchende friske subjekter. Vitamin K statusen til hvert subjekt ble avlest ved å måle forholdet mellom karboksylert og ikke-karboksylert osteokalcin (cOC/ucOC forhold), som er den mest sensitive biomarkøren for ekstrahepatisk vitamin K status (B. Panis et al., Bone 2006; 39:1123-1129). Pasienter som lider av osteoartritt og kondropati var relativt unge og ble sammenlignet med en ung referansegruppe (A)1 pasienter med reumatoid artritt var eldre og således sammenlignet med en eldre referansegruppe (B). Konformasjonsspesifikke undersøkelser for osteokalcin ble oppnådd fra Takara (Japan). Se Tabell 1 nedenfor.
Dette eksperimentet demonstrerer at vitamin K statusen (uttrykt som karboksyleringsgrad av sirkulerende osteokalcin) blir signifikant redusert hos subjekter med osteoartritt, kondropati og reumatoid artritt sammenlignet med den friske populasjonen.Tabell 1Eksperiment 2: MGP karboksylering i løpet av langtids fiskeoljeinntak og effektene av MK-7 inntak ved 10 μg/dagTyve friske hannkjønnsindivider (43 ± 8 års alder) ble innrullert i studien. Den midlere kroppsmasseindeksen var 25,1 ± 3,5 kg/m2. Alle subjekter mottok 5 g fiskeolje (som inneholder 35% EPA, 25% DHA og 10% andre n-3 PUFA) per dag i løpet av 4 måneder. I løpet av de siste 3 månedene av studien mottok alle frivillige ytterligere en myk gelkapsel per dag som ga 10 μg av MK-7. Blodprøver ble samlet opp i citrat hver måned for fremstilling av blodplaterik plasma. Det endogene trombinpotentialet (ETP), som reflekterer den totale trombinaktiviteten i løpet av koagulering, ble overvåket i henhold til H.C. Hemker et al. (Pathophysiology of Haemostasis and Thrombosis 2003;33:4-15). Karboksylerte og ikke-karboksylerte matriks Gla-protein (MGP) prøver ble overvåket ved anvendelse av sandwich ELISAer basert på konformasjons-spesifikke antistoffer oppnådd fra VitaK BV (Maastricht, Nederland) med normalt oppsamlet plasma som en referanse. Se Figur 1. Forholdet mellom karboksylert og ikkekarboksylert MGP blir tatt som et mål for vaskulær vitamin K status. Alle verdier ble uttrykt som en prosent av de i den oppsamlede referanseplasmaen. Forandringen i ETP var statistisk signifikant (p<0,05) etter en måned og holdt seg på denne måten i løpet av de etterfølgende månedene. Forandringen i MGP karboksylering var også signifikant etter en måned, men signifikansen forsvant i løpet av måneder 2, 3 og 4.
Dette eksperimentet demonstrerer at den fiskeolje induserte hypokoagulerkingsevnen ikke blir motvirket av de lave dosene av MK-7 som kreves for å opprettholde MGP karboksylering ved sitt opprinnelige nivå.Eksperiment 3: Osteokalcinkarboksylering i løpet av langtids fiskeoljeinntak og effektene av MK-7 inntak ved 10 μg/dagI det samme eksperiment som beskrevet ovenfor ble også serum oppsamlet, hvori karboksylerte og ikke-karboksylerte osteokalcinprøver ble overvåket ved anvendelse av konformasjonsspesifikke osteokalcin kit fra Takara (Japan). Forandringen i osteokalcin karboksylering var signifikant etter en måned, men signifikansen forsvant i løpet av måned 3 og 4. Se Figur 2. Dette eksperimentet demonstrerer at den fiskeoljeinduserte hypokoagulerkingsevnen ikke blir motvirket av de lave dosene av MK-7 som kreves for å opprettholde osteokalsinkarboksylering ved det opprinnelige nivå.Eksperiment 4: Stabilitet av MK-7 i fiskeolje og krilloljeSammensetninger som beskrevet i eksemplene 2 og 4 (MK-7 løst i fiskeolje og krillolje, respektivt) ble fremstilt til en sluttkonsentrasjon på 2 μg MK-7 per g olje. Prøvene ble fremstilt i forseglede glassflasker og holdt i et mørkt rom ved romtemperatur, 40ºC og 100ºC, respektivt. Ved regulære tidspunkter ble prøver tatt og analysert for deres MK-7 innhold. Se Figur 3. Det ble ikke observert tap av MK-7, selv etter 2 uker ved 100ºC. Dette eksperimentet demonstrerer den eksepsjonelle stabiliteten til MK-7 løst i fiskeolje og krillolje.Eksperimenter 5-9: CellekulturstudierDenne serien av cellekultureksperimenter beskriver vitamin K opptak og metabolisme under forskjellige betingelser. De følgende formene av vitamin K ble sammenlignet: K1, MK-4, MK-7, MK-8 og MK-9. De ble testet i tre forskjellige celletyper: vaskulære glattmuskelceller, osteoblastlignende MG-63 cellelinje og hepatocyttlignende HepG2 cellelinje. I alle eksperimentene ble vitaminene anvendt som en blanding som inneholder 1 μmol/L av hvert vitamin. Alle data er gjennomsnittsverdier av triplikate eksperimenter.
Sammensetningen (v/v) av de forskjellige dyrkningsmediene var:Eksperiment 5Her har vi sjekket stabiliteten til de forskjellige formene av vitamin K (1 μM av hver) i tre celledyrkningsmedier uten celler tilstede. Dataene er gitt i Figur 4.Konklusjon: I alle tre dyrkningsmediene var vitaminene K1, MK-7, MK-8, og MK-9 relativt stabile i løpet av 48 timer, mens MK-4 viste en reduksjon til verdier mellom 70 og 80% av grunnlinjen i løpet av de første 24 timene og mellom 60 og 70% av grunnlinjen etter 48 timer. Grunnen for denne reduksjonen er fremdeles uklar, men betingelser må velges på en slik måte at forsvinningen av MK-4 ikke influerer data for cellulært opptak av vitamin K. For å holde MK-4 tapet lavest mulig, ble alle ytterligere eksperimenter utført i løpet av ikke lenger enn 24 timer.Eksperiment 6Celler ble dyrket til 80% konfluens hvoretter vitamin K ble tilsatt i forskjellige konsentrasjoner (se Figurer 5A-C). Den tilsatte vitamin K konsentrasjonen gis som nmol/L dyrkningsmedium, vitamin K oppnådd gis som nmol/g av cellulært protein. Bemerk de forskjellige skalaene for hvert vitamin.Konklusjoner:1. Dose-responskurvene for alle vitaminer er horisontale mellom 500 og 1000 nmol/L; således arbeidet vi under metningsbetingelser og selv reduksjonen av MK4 (per i dag ikke forstått) vil ikke berøre utkommet av ytterligere studier.2. Overraskende var det en svært stor forskjell i vitamin K opptak av de forskjellige cellene, hvor vaskulære glattmuskelceller ga de høyeste og MG63 de laveste verdiene. Dette er demonstrert i Figur 5D, hvor vi har plottet MK-7 opptak i de tre celletypene ved samme skala.
3. I alle systemene, men spesielt i de ekstrahepatiske cellene, ble MK-7 overraskende tatt opp bedre enn de andre K vitaminene. Dette ble ytterligere demonstrert i følgende eksperimenter.Eksperiment 7Cellulært opptak av K vitaminer ble fulgt over tid. I alle tilfeller ble en blanding av de forskjellige K vitaminene (1 μmol/L sluttkonsentrasjon i dyrkningsmediet) tilsatt til cellene etter at de hadde vokst til 80% konfluens. Data er gitt i Figur 6. Overraskende ble MK-7 tatt bedre opp enn noen av de andre K vitaminene. Mekanismen bak denne cellulære preferansen for MK-7 er ikke helt klar.Konklusjoner:1. Opptaket flater ut etter 4 timer og når platenivåer ved 8 timer;2. Graden av opptak og verdien for platånivåene er forskjellig for hvert vitamin;3. MK-7 tas opp bedre enn noen av de andre vitaminene i alle tre cellesystemer.Eksperiment 8Under normale betingelser blir alle former av vitamin K tatt opp i deres quinonform, og de er redusert til hydroquinonet før de er aktive som en kofaktor for enzym gammaglutamylkarboksylasen. I løpet av karboksyleringen ble de oksidisert til epoksider, som kan reduseres med det membranbundede enzymet VKOR. VKOR danner målet for legemidler kjente som koumarinderivater, som inaktiverer enzymet og således blokkerer resirkuleringen av K epoksider. Vitamin K quinoner (og ikke epoksidene) kan reduseres av et andre enzymsystem, kjent som DT diaforase. Således blir virkningen av koumarinderivativer, slik som warfarin, antagonisert ned ekstra vitamin K. I tillegg blir hvert molekyl av vitamin K som anvendes under nærvær av warfarin, omdannet til det korresponderende epoksidet, som ikke kan anvendes videre. Således er K epoksidkonsentrasjonen et direkte mål for mengden av vitamin K anvendt i løpet av warfarin behandling. Koumarinderivater blir omfattende anvendt som orale antikoagulanter; deres virkningsmodus er basert på inhiberingen av proppefaktorkarboksylering i leveren. Interferens med koumarinderivater er således en potentiell risiko ved vitamin K supplementer. derfor har vi undersøkt om og i hvilken grad de forskjellige K vitaminene interfererer med warfarin. I studien som er beskrevet blir 10 μmol/L warfarin tilsatt til dyrkningsmediet 18 timer før tilsetning av vitamin K. Også i løpet av inkubering med K vitaminer var denne konsentrasjonen av warfarin tilstede. Resultatene er vist i Figur 7.
I MG63 cellelinjen kunne vi kun identifisere MK-4 epoksid (MK4-O), i de andre systemene ble mer K vitamine detektert i deres epoksidform. I alle tilfellene er det opplagt at de mer vannløselige formene av vitamin K (MK-4 og K1) er i stand til å passere effekten av warfarin, mens ved økende hydrofobisitet blir interferensen med warfarin mindre. Den viktigste celletypen i denne serien er HepG2 cellelinjen, siden denne representerer hepatocyttene, plassen hvor blodproppefaktorer syntetiseres. Det er nærliggende fra Figur 7 at det er en invers korrelasjon mellom interferensen med warfarin og hydrofobisitet til vitamin K prøvene. MK-9 epoksider ble nesten ikke dannet. På dette tidspunktet var MK-10 og MK-11 ikke kommersielt tilgjengelige, men det forventes ved ekstrapolering at disse langkjedede menaquinonene ikke vil interferere i det hele tatt, og kan sikkert gis som et supplement selv til pasienter på oral antikoagulant (koumarin) behandling.Konklusjoner:1. Kortkjedede K vitaminer K1 og MK-4 interfererer vesentlig med warfarin, mens interferens med langkjedede menaquinoner er mindre.2. Anvendelse av K-vitaminer under nærvær av warfarin er inverst relatert til lengden av sidekjeden: MK-7 > MK-8 > MK-9.3. På basis av disse eksperimentene kan det forventes at MK-9 og MK-10 ikke vil interferere på en klinisk relevant måte med oral antikoagulantbehandling.Eksperiment 9Etter å ha demonstrert at langkjedede menaquinoner blir absorbert godt av de forskjellige cellene, og at de nesten ikke anvendes i løpet av warfarinbehandling, gjenstår det å demonstrere at disse vitamin K prøvene blir aktivt anvendt under ikkeinhibert (warfarinfrie) betingelser. Siden under standard celledyrkningsbetingelser ingen epoksider blir dannet, har vi anvendt underoptimale dyrkningsbetingelser ved å redusere fosterkalveserumet i dyrkningsmediet til 1% (v/v). Dette resulterte i vesentlig epoksiddannelse. Resultatene er vist i Figur 8. Igjen ble de kortkjedede vitamin K epoksidene funnet å akkumulere, særlig i vaskulære glattmuskel MG63 celler. Vi tolket disse dataene som fordelaktig resirkulering av de langkjedede menaquinonene under betingelser med cellesulting. Alternativt kan disse dataene forklares som ingen anvendelse av de langkjedede menaquinonene. Dette ble utelukket i et eksperiment hvori VSMC og MG63 ble dyrket ved 1% FCS og med kun en enkel form av vitamin K tilstede (1 μmol/L). Ved anvendelse av konformasjonsspesifikke testkit for karboksylert osteokalcin (Takara, Japan) og karboksylert matriks Gla-protein (VitaK, Nederland) ble det funnet at i vaskulære glattmuskelceller ble MGP karboksylering stimulert med
vitamin K1, MK-4 og MK-7 for å nå følgende MGP nivåer i dyrkningsmediet etter 24 timer inkubering: Karboksylert matriks Gla-protein under nærvær av K1 : 12,4 ng/mL, MK-4: 10,7 ng/mL, MK-7: 13,5 ng/mL. Karboksylert osteokalcin under nærvær av K1 : 3,2 ng/mL, MK-4: 4,1 ng/mL, MK-7: 3,9 ng/mL.Disse dataene demonstrerer at langkjedede menaquinoner så vel som K1 og MK-4 er aktive kofaktorer for den vitamin K avhengige karboksylasen, og at fravær av epoksider må være resultatet av foretrukket resirkulering.
Claims
Patentkrav1.Farmasøytisk eller nutrasøytisk produkt for oral administrering som omfatter minst en forbindelse innenfor vitamin K2 klassen av forbindelser bestående av MK-7, MK-8, MK-9 og MK-10, i kombinasjon med minst en av en polyumettet fettsyre, enten renset eller i form av en marin olje, hvori nevnte produkt er en tablettformulering eller en kapselformulering.2.Farmasøytisk eller nutrasøytisk produkt, som omfatter minst en forbindelse innenfor vitamin K2 klassen av forbindelser som er valgt fra MK-7, MK-8, MK-9 og MK-10, for forebygging eller terapi av minst en av kardiovaskulær-, ben- og bruskrelaterte sykdommer eller forstyrrelser hos mennesker og dyr, og ytterligere omfatter minst en av en polyumettet fettsyre, enten renset eller i form av en marin olje hvori vitamin K2 forbindelsen administreres i en dosering i området fra 5-50 μg per dag.3.Produktet ifølge krav 1 for profylakse eller terapeutisk behandling av minst en av aterosklerose, arteriosklerose, osteoporose, osteoartritt eller en inflammatorisk eller degenerativ sykdom omfattende brusk.4.Produkt ifølge krav 1, hvori nevnte polyumettede fettsyre er i form av fiskeolje eller krillolje eller hvori nevnte polyumettede fettsyre er en n-3 polyumettet fettsyre, foretrukket EPA eller DHA eller en blanding derav, eller hvor nevnte fettsyre er en kombinasjon av EPA og DHA i form av deres triglycerider eller etylestere.5.Produkt for anvendelse ifølge krav 2, hvori nevnte polyumettede fettsyre er i form av fiskeolje eller krillolje eller hvori nevnte polyumettede fettsyre er en n-3 polyumettet fettsyre, foretrukket EPA eller DHA eller en blanding derav, eller hvor nevnte fettsyre er en kombinasjon av EPA og DHA i form av deres triglycerider eller etylestere.
Drawings
Priority
14.07.2006 NO 2006329114.07.2006 NO 2006329206.09.2006 NO 20063988