Key information

Title: Fremgangsmåte for å maskere lukt av en fiskesemiokjemisk forbindelse i vann, og en fôrsammensetning som inneholder maskeringsekstrakter.
Application number: 20120660
Case type: PCT-based
Status: 07.06.2021 P.g.a. manglende svar. Søker har ikke begjært gjenopptakelse
Filed: 06.06.2012
Divided to: 20140778201407832014078520140787
Priority: 02.12.2009 NO 20093460
International application date: 02.12.2010
International application number: PCT/NO2010/000442
Effective date: 02.12.2010
Publicly available: 13.06.2012
Applicant: Ewos Innovation AS (NO)
Inventor: José Luis González Vecino (NO) et al.
Agent: ACAPO AS (NO)

Abstract and drawing

Disclaimer: This text has been machine-scanned and may contain errors – please refer to "Publications" for legally binding content.

Det beskrives en fremgangsmåte for å maskere lukten av isoforon i vann. Også beskrevet er en fremgangsmåte for å redusere attraksjon mellom en parasitt og en fisk. Det beskrives også fiskeforsammensetninger, og anvendelse av en forbindelse eller ekstrakt for å hindre og/eller behandle en parasittinfeksjon i fisk.

Publications

Checking availability of the latest published version...

Documents

Expand

Download files (24)

Date

Date	Doc. No.	Process	Case number	In/Out	Journal description	To/from
10.11.2021	12-01	Saksbehandling	20120660	UT	Endelig Henleggelse	ACAPO AS
13.09.2021	11-01	Saksbehandling	20120660	UT	PT Henlagt manglede svar	ACAPO AS
07.12.2020	10-02	Saksbehandling	20120660	UT	PT report 04:54:45
07.12.2020	10-01	Saksbehandling	20120660	UT	Realitet patent	ACAPO AS
23.05.2020	09-01	Saksbehandling	20120660	INN	Korrespondanse (Hovedbrev inn)	ACAPO AS
23.10.2012	08-02	Saksbehandling	20120660	INN	Overdragelsesdokument	Acapo AS
23.10.2012	08-01	Saksbehandling	20120660	INN	Korrespondanse (hoved dok)	Acapo AS
05.10.2012	07-04	Saksbehandling	20120660	INN	Hovedbrev	Acapo AS
05.10.2012	07-03	Saksbehandling	20120660	INN	Overdragelsesdokument	Acapo AS
05.10.2012	07-02	Saksbehandling	20120660	INN	Fullmakt	Acapo AS
05.10.2012	07-01	Saksbehandling	20120660	INN	Korrespondanse (hoved dok)	Acapo AS
31.07.2012	05-03	Saksbehandling	20120660	INN	communication from IB	Acapo AS
31.07.2012	05-02	Saksbehandling	20120660	INN	PCT pamflett (WO2011068415 A9 corrected version)	Acapo AS
31.07.2012	05-01	Saksbehandling	20120660	INN	Korrespondanse (hoved dok)	Acapo AS
12.07.2012	04-01	Saksbehandling	20120660	UT	PT PFC Defect Letter	Acapo AS
18.06.2012	03-03	Saksbehandling	20120660	INN	Hovedbrev	Acapo AS
18.06.2012	03-02	Saksbehandling	20120660	INN	Krav	Acapo AS
18.06.2012	03-01	Saksbehandling	20120660	INN	Korrespondanse (hoved dok)	Acapo AS
13.06.2012	02-04	Saksbehandling	20120660	INN	Patenttegninger	Acapo AS
13.06.2012	02-03	Saksbehandling	20120660	INN	Beskrivelse	Acapo AS
13.06.2012	02-02	Saksbehandling	20120660	INN	Hovedbrev	Acapo AS
13.06.2012	02-01	Saksbehandling	20120660	INN	Korrespondanse (hoved dok)	Acapo AS
06.06.2012	01-02	Saksbehandling	20120660	INN	PCT pamflett
06.06.2012	01-01	Saksbehandling	20120660	INN	National Patent Application Form

Description, claims and drawings

Disclaimer: This text has been machine-scanned and may contain errors – please refer to "Publications" for legally binding content.

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å maskere lukten av fiskesemiokjemikalier i vann. Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for å redusere attraksjon mellom en parasitt og en fisk. Oppfinnelsen vedrører også fiskeforsammensetninger, og anvendelse av en forbindelse eller ekstrakt for å hindre og/eller behandle en parasittinfeksjon i fisk.

Sjølus ( Lepeophtheirus salmonis, Caligus sp) er det viktigste patogen som for tiden påvirker den globale lakseoppdrettsindustri og har en betydelig effekt på mange produksjonsområder. Økonomisk effekt for akvakulturindustrien er stor på grunn av høye årlige tap. Det er også en kontinuerlig bekymring over effekten av lakseopp-drett på ville laksepopulasjoner med økende tetthet av sjølus tilgrensende til disse produksjonssteder. Reguleringsmidler har stolt på anvendelse av et antall kjemoterapeutiske midler siden 1970-tallet. Redusert effektivitet har nå blitt rapportert for alle forbindelser, med unntak av insektvekstsreguleringsmidlene (IGR) diflubenzuron og teflubenzuron. Ytterligere fremgangsmåte er derfor nødvendig for effektivt å regulere sjølus, i forbindelse med medisinering av sjølus.

Slekten Lepeophtheirus av sjølus er en vertsspesifikk parasitt. L. salmonis vil kun komplettere sin livssyklus på salmonide arter, selv om mobile stadier noen ganger kan observeres som opportunister for ytterligere fiskearter. Andre Lepeophtheirus sp. vil rette seg mot et smalt spekter av andre fiskearter.

Lepeophtheirus- genus av sjølus har utviklet en rekke mekanismer for å undertrykke immunresponsen til deres bestemte verter. For å overvinne en potensiell fatal inflam-matorisk reaksjon frigjør sjølusen en rekke sekretoriske/eksretoriske produkter (SEP) inn i vertsvevet, via spyttkjertler. Prostaglandiner (PGE2), alkalisk fosfatase og en rekke trypsinlignende proteaser har blitt identifisert som SEPer i sjølus. Det er antatt at flere ytterligere ikke-identifiserte faktorer så som fosfatase, apyrase og makrofag-inhiberende faktor også er tilstede.

L. salmonis har en signifikant immunundetrrykkende effekt på en rekke responser i Atlantisk laks, inkluderende redusert respiratorisk utbrudd, lavere makrofagaktivitet, øket apoptose, nekrose, redusert antall mukosale celler og nedregulering av immun-gener så som interleukin IL-1 R og MHC-1. Undertrykkingen foregår ved lokaliserte tilfestingssteder, selv om en mer generalisert effekt kan forekomme ved høyere nivåer av sjølusinfeksjon. Straks de har undertrykket immunsystemet til verten er lusene i stand til å strekke et frontalt filament for en sikker tilfesting. Dette er intimt assosiert med vertsvevet og i stand til å overleve enhver påfølgende immunrespons fra denne art.

Lepeophtheirus sp. er ikke i stand til å undertrykke immunsystemet av ikke-vertsarter. Dersom lusen prøver å sette seg på en resistent fiskeart vil immunresponsen røpe den. Således er korrekt identifisering av verten essensiell for tilfesting og over-levelse av Lepeophtheirus sp.

Sjølus har en avansert luktesans og kontakt-kjemoreseptorer som er i stand til nøy-aktig identifisering av spesifikke vertsmolekyler. Semiokjemikalier (atferdsmodifi-serende kjemikalier) anvendes av en rekke leddyr i kjemiske kommunikasjons-systemer for å lokalisere en vert, make oviposjonssteder. Tilsvarende, mange leddyr anvender kjemiske tegn for å identifisere og søke etter maker.

Lus innen Ca//'gus-genus har et stort antall potensielle verter. C elongatus er kjent å infisere over 80 vertsarter verden over. Caligus har blitt funnet å oppvise et større spekter og kvantitet av serin- og ikke-serin-proteaser enn L. salmonis og dette kan assistere i å bekjempe et større antall immunresponser fra mange forskjellige arter. I tillegg benytter Caligus en forskjellig tilfestingsmekanisme som ikke er så intimt assosiert med vertsvevet. Caligus fjerner det epidermale vev fra skjellene og deretter festes det frontale filament direkte til de klarerte skjell via en basalplate. Det frontale filament er mye lenger enn det som benyttes av L. salmonis og dette muliggjør at lusen kan forbli i noe avstand fra vertens immunsystem. Til tross for denne general-iserte tilpasning oppviser noen Caligus- arter fremdeles en høy grad av verts-spesifisitet. Dette kan utvikles i populasjoner i området hvor en bestemt verts-populasjon er overveldende så som Caligus rogercresseyi som nå er den domi-nerende sjølusart i laksefarmer i Chile.

Gjennom atferdsforsøk har hypotesen om at inter- og intraspesifikke forhold av lakselus, C. rogercresseyi er mediert av semiokjemiske forbindelser blitt testet. Det har blitt vist at vertsartene som er studert: det vil si Coho-laks, Atlantisk laks og Regnbueørret utsender kjemiske signaler som tiltrekker seg sjølus.

Formålet med den foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en forsammensetning og en ny fremgangsmåte for å hindre og regulere sjølusattraksjon til, og infeksjoner i fisk, fortrinnsvis Salmonidae som er enkelt appliserbar, effektiv ved langtidsbruk og vurderes som miljøvennlig og mindre toksisk enn mange kjente kjemoterapeutiske midler. Spesielt er det et formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en forsammensetning og en fremgangsmåte for å maskere de semiokjemiske forbindelser for å redusere attraksjon av sjølus for Salmonidae.

Et første aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å maskere lukten av et fiskesemiokjemikalium i vann, karakterisert ved at et ekstrakt eller forbindelse tilsettes til nevnte vann eller administreres til en fisk i nevnte vann, hvor nevnte ekstrakt eller forbindelse er valgt blant;

i) et ekstrakt (eller olje) fra hvitløk, rosmarin, lavendel eller pors, eller ii) en forbindelse av formel (I);

hvor hver R1 uavhengig av hverandre er Ci-C4-alkyl eller C2-C3-alkenyl eller C2-C3-alkynyl, eller iii) en forbindelse av formel (II);

I en foretrukket utførelse er nevnte fiskesemiokjemikalium forbindelse 1-octen-3-ol. I en foretrukket utførelse er nevnte fiskesemiokjemikalium 6-metyl-5-hepten-2-on.

Fortrinnsvis er nevnte vann-Salmonidae-kondisjonert sjøvann eller nevnte fisk i nevnte vann er en Salmonidae.

Fortrinnsvis, nevnte Salmonidae er valgt blant gruppen som består av atlantisk laks, coho laks, Chinook, regnbueørret, arktisk ørret og andre oppdrettede laksearter.

Fortrinnsvis, fremgangsmåten reduserer attraksjon mellom en parasitt og nevnte fisk.

Fortrinnsvis, nevnte parasitt er en ectoparasitt, mer fortrinnsvis sjølus ( Lepeophtheirus salmonis, Caligus sp.).

I en foretrukket utførelse er nevnte forbindelse en forbindelse av formel (I) over. Fortrinnsvis, minst én av R1 er-CH2-CH=CH2 eller-CH=CH-CH3. Fortrinnsvis, begge R1-gruppene er identiske, og er enten -CH2-CH=CH2 eller-CH=CH-CH3. Fortrinnsvis, nevnte forbindelse er diallyl disulfid eller diallyl sulfid.

I en foretrukket utførelse er nevnte forbindelse en forbindelse av formel (II) over. Fortrinnsvis, R1 er en Ci-C4-alkyl. Fortrinnsvis, nevnte forbindelse er butyl isotiocyanat.

Fortrinnsvis, nevnte forbindelse er propyl isotiocyanat. Fortrinnsvis, R1 er en C2-C3-alkenyl. Fortrinnsvis, nevnte forbindelse er alkyl isotiocyanat. Fortrinnsvis, nevnte fenylalkyl er fenylmetyl, fenyletyl eller fenylpropyl. Fortrinnsvis, nevnte fenylalkyl er fenyletyl. Mer foretrukket, nevnte forbindelse er allyl-, propyl-, butyl-, pentenyl-, fenyetyl-isotiocyanater, og mer foretrukket er nevnte forbindelse 2-fenyletyl isotiocyanat.

Et andre aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å redusere attraksjon mellom en parasitt og en fisk, eller for å redusere angrep eller infeksjon av en parasitt i en fisk, eller for behandling av en parasittinfeksjon i en fisk, karakterisert ved at et ekstrakt eller forbindelse tilsettes til nevnte vann eller administreres til en fisk i nevnte vann, og nevnte ekstrakt eller forbindelse er valgt blant;

i) et ekstrakt (eller olje) fra hvitløk, rosmarin, lavendel eller pors, eller ii) en forbindelse av formel (I);

hvor hver R1 uavhengig av hverandre er Ci-C4-alkyl eller C2-C3-alkenyl eller C2-C3-alkynyl, eller iii) en forbindelse av formel (II);

hvor R1 er Ci-C4-alkyl eller C2-C3-alkenyl eller C2-C3-alkynyl, eller fenylalkyl.

Fortrinnsvis er nevnte vann-Salmonidae-kondisjonert sjøvann eller nevnte fisk i nevnte vann er en Salmonidae.

Fortrinnsvis, nevnte Salmonidae er valgt blant gruppen som består av atlantisk laks, coho laks, Chinook, regnbueørret, arktisk ørret og andre oppdrettede laksearter.

Fortrinnsvis, fremgangsmåten reduserer attraksjon mellom en parasitt og nevnte fisk.

Fortrinnsvis, nevnte parasitt er en ectoparasitt, mer fortrinnsvis sjølus ( Lepeophtheirus salmonis, Caligus sp.).

I en foretrukket utførelse er nevnte forbindelse en forbindelse av formel (II) over. Fortrinnsvis, R1 er en Ci-C4-alkyl. Fortrinnsvis, nevnte forbindelse er butyl isotiocyanat.

Et tredje aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrører en forsammensetning omfattende konvensjonelle foringredienser så som lipider, proteiner, vitaminer, karbohydrater og mineraler, karakterisert ved at foret omfatter rosmarin eller pors. Fortrinnsvis, nevnte rosmarin eller pors maskerer lukten av en fisk, fortrinnsvis en Salmonidae. Foretrukket, nevnte forbindelse eller materialer maskerer lukten av salmonider i Salmonidae kondisjonert sjøvann. Fortrinnsvis, nevnte forbindelse eller materiale maskerer lukten av isoforon eller 1-octen-3-ol eller 6-metyl-5-hepten-2-on.

Et fjerde aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrører en forsammensetning omfattende konvensjonelle foringredienser så som lipider, proteiner, vitaminer, karbohydrater og mineraler, karakterisert ved at foret omfatter en forbindelse av formel (I):

hvor hver R1 uavhengig av hverandre er Ci-C4-alkyl eller C2-C3-alkenyl eller C2-C3-alkynyl.

Foretrukket, begge R1-gruppene er identiske, og er enten -CH2-CH=CH2 eller

Et femte aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrører en forsammensetning omfattende konvensjonelle foringredienser så som lipider, proteiner, vitaminer, karbohydrater og mineraler, karakterisert ved at foret omfatter en forbindelse av formel (II);

hvor R1 er Ci-C4-alkyl eller C2-C3-alkenyl eller C2-C3-alkynyl, eller fenylalkyl.

Fortrinnsvis, nevnte forbindelse er allyl-, propyl-, butyl-, pentenyl-, fenyletyl-isotiocyanater.

Fortrinnsvis, i samsvar med forsammensetningen i samsvar med det tredje, fjerde og femte aspekt av foreliggende oppfinnelse, er nevnte forbindelse eller ekstrakt i foret i et konsentrasjonsområde av 0,01-0,5, fortrinnsvis i en konsentrasjon av 0,125% basert på vekt av foret.

Et sjette aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av forbindelse eller ekstrakt for hindring og/eller behandling av en parasittinfeksjon i fisk, fortrinnsvis en Salmonidae, hvor nevnte ekstrakt eller forbindelse er valgt blant;

hvor hver R1 uavhengig av hverandre er Ci-C4-alkyl eller C2-C3-alkenyl eller C2-C3-alkynyl, eller iii) en forbindelse av formel (II);

hvor R1 er Ci-C4-alkyl eller C2-C3-alkenyl eller C2-C3-alkynyl, eller fenylalkyl.

Foretrukket, forbindelsen eller ekstraktet anvendes for fremstilling av en farmasøytisk eller nutrasøytisk sammensetning, eller et funksjonelt for.

Utførelse av oppfinnelsen vil nå bli beskrevet ved hjelp av eksempler med referanse til følgende figurer: Figur 1 a viser retningsdoserespons av L. salmonis copepodider i forhold til sjøvann-kontroll, 100 deler per trillion (ppt) isoforon, 100 ppt isoforon pluss 100 ppt hvitløkolje og 100 ppt hvitløkolje alene. Figur 1 b viser aktiveringsdoserespons av L. salmonis copepodider i forhold til sjøvannskontroll, 100 deler per (ppt) isoforon, 100 ppt isoforon pluss 100 ppt hvitløkolje og 100 ppt hvitløkolje alene. Figur 2a viser retningsdoserespons av L. salmonis copepodider i forhold til sjøvann-kontroll, i laksekondisjonert vann (SCW), SCW pluss 50 ppt diallyl disulfid og SCW pluss 10 ppt diallyl sulfid. Figur 2b viser aktiveringsdoserespons av L. salmonis copepodider i forhold til sjøvannkontroll, laksekondisjonert vann (SCW), SCW pluss 50 ppt diallyl disulfid og 10 ppt diallyl sulfid. Figur 3a retningsdoserespons av L. salmonis copepodider i forhold til sjøvann-kontroll, laksekondisjonert vann (SCW) og SCW pluss 10,1 og 0,1 ppt diallyl sulfid. Figur 3b viser aktiveringsdoserespons av L. salmonis copepodider til sjøvannkontroll, laksekondisjonert vann (SCW) and SCW pluss 10,1 og 0,1 ppt diallyl sulfid. Figur 4a viser retningsdoserespons av L. salmonis copepodider i forhold til sjøvann-kontroll, laksekondisjonert vann (SCW) og SCW pluss 4-pentenyl, 2-fenyletyl og butyl isotiocyanat ved 100 ppt. Figur 4b viser aktiveringsdoserespons av L. salmonis copepodider til sjøvannkontroll, laksekondisjonert vann (SCW) og SCW pluss 4-pentenyl, 2-fenyletyl og butyl isotiocyanat ved 100 ppt. Figur 5a viser retningsdoserespons av L. salmonis copepodider til sjøvannkontroll, laksekondisjonert vann (SCW) og SCW pluss 100 ppt propyl isotiocyanat. Figur 5b viser aktiveringsdoserespons av L. salmonis copepodider til sjøvannkontroll, laksekondisjonert vann (SCW) og SCW pluss 100 ppt propyl isotiocyanat. Figur 6a retningsdoserespons av L. salmonis copepodider til sjøvannkontroll, laksekondisjonert vann (SCW) og SCW pluss butyl isotiocyanat ved 1, 10 og 100 deler per trillion (ppt). Figur 6b viser aktiveringsdoserespons av L. salmonis copepodider til sjøvannkontroll, laksekondisjonert vann (SCW) og SCW pluss butyl isotiocyanat ved 1,10 og 100 deler per trillion (ppt). Figur 7a retningsdoserespons av L. salmonis copepodider til sjøvannkontroll, laksekondisjonert vann (SCW) og SCW pluss allyl isotiocyanat ved 1, 10 og 100 deler per trillion (ppt). Figur 7b viser aktiveringsdoserespons av L. salmonis copepodider til sjøvannkontroll, laksekondisjonert vann (SCW) og SCW pluss allyl isotiocyanat ved 1, 10 og 100 deler per trillion (ppt). Figur 7c viser retningsdoserespons av L. salmonis copepodider til sjøvannkontroll, laksekondisjonert vann (SCW) og SCW pluss allyl isotiocyanat ved 1,10 og100 deler per trillion (ppt). Figur 7d viser retningsdoserespons av L. salmonis copepodider til sjøvannkontroll, laksekondisjonert vann (SCW) og SCW pluss allyl isotiocyanat ved 1, 10 og 100 deler per trillion (ppt). Figur 7e viser aktiveringsdoserespons av L. salmonis copepodider til sjøvannkontroll, laksekondisjonert vann (SCW) og SCW pluss allyl isotiocyanat ved 1, 10 og 100 deler per trillion (ppt), hvor blokker 1 og 2 er kombinert. Figur 8a viser retningsdoserespons av L. salmonis copepodider til sjøvannkontroll, laksekondisjonert vann (SCW) og SCW pluss posr, lavendel og rosmarin ved 100 ppt. Figur 8b viser aktiveringsdoserespons av L. salmonis copepodider til sjøvannkontroll, laksekondisjonert vann (SCW) og SCW pluss pors, lavendel og rosemarin ved 100 ppt. Figur 9a viser retningsdoserespons av L. salmonis copepodider til sjøvannkontroll, laksekondisjonert vann (SCW) og SCW pluss 100 og 1000 ppt pors. Figur 9b aktiveringsdoserespons av L. salmonis copepodider til sjøvannkontroll, laksekondisjonert vann (SCW) og SCW pluss 100 og 1000 ppt pors. Figur 10a viser retningsdoserespons av L. salmonis copepodider til sjøvannkontroll, laksekondisjonert vann (SCW) og SCW pluss 100 og 1000 ppt lavendel. Figur 10b viser aktiveringsdoserespons av L. salmonis copepodider til sjøvannkontroll, laksekondisjonert r (SCW) og SCW pluss 100 og 1000 ppt lavendel. Figur 11. Chemotaxis respons av C. rogercresseyi Copepodider til stimuli maskert med forbindelse B1(A), B2(B) y B3(C) med forskjellige konsentrasjoner (* P < 0,05; Chi-square test) Figur 12. Preferanseindeks av C. rogercresseyi copepodider til vertssignal maskert med forbindelser B1(A), B2 (B) y B3(C) ved forskjellige konsentrasjoner. Figur 13. Fisk matet med butyl isotiocyanat (B1) viste en signifikant reduksjon på 42 % i nivåer av sjølus sammenlignet med kontroller (figur 2). Der var en trend for en reduksjon i lusenivåer med både diallyl sulfid (B2) og diallyl disulfid (B3)

Eksempel 1: In vitro undersøkelse av effekten av forskjellige forbindelser på Lepeophtheirus salmonis

Et antall planteprodukter ble testet for deres evne til å maskere lakselukt for å inhibere attraksjon av lus til laks og for å hindre bosetning av Lsalmonis på laks. Et Y-rør atferdsarena ble utviklet og anvendt for å teste planteekstraktene/- forbindelsenes evne til å inhibere copepodidattraksjon til laksekondisjonert vann.

• korsbærende isotiocyanater; allyl-, propyl-, butyl-, pentenyl-, fenyetyl-isotiocyanater

Ovigerous hunnkjønn Lepeophtheirus salmonis ble innsamlet fra Atlantisk laks. Materialet ble transportert på is til laboratoriet med rent sjøvann for sortering. Vann fra kildestedet ble samlet og anvendt for påfølgende oppdrett av eggstrenger. Strengene ble fjernet forsiktig fra deres tilfestingspunkt til voksne hunnkjønn ved anvendelse av ultrafine pinsetter og plassert i 21 koniske glassflasker. Alle flaskene ble luftet for å holde strengene i suspensjon og for å fremme utklekking. Eggstrengene ble oppdrettet under en 161 lys- 81 mørke-regime og ved 12 °C omgivende temperatur i vann fra kildestedet.

Utvikling av eggene til copepodider ble bestemt som en funksjon av gjennomsnittlig temperatur ved å følge Johnson og Albright (1991). Strengene ble monitorer! to ganger daglig for utklekking av nauplii og påfølgende utvikling til copepodidfasen, ved hvilket punkt de ble fjernet for anvendelse i adferdsbioanalysene.

Fiskekondisjonert vann ble samlet som beskrevet av Devine et al. (2000) og Ingvarsdottir et al. (2002b). Atlantisk laks, S. salar ble oppbevart i akvarium inneholdende artifisielt sjøvann (32 %o). Fiskekondisjonert vann ble oppnådd ved å plassere fisken i 241 inn i en sirkuleringskanal (20 cm x 25 cm x 420 cm) fylt med artifisielt sjøvann (100 I) sirkulerende ved en hastighet på 30 cm s'\ Lufting ble tilveiebrakt ved bobling av komprimert luft inn i vannrennen. Standardisering av fiskelukt i vannet ble oppnådd ved anvendelse av vannet i en konsentrasjon på 8-10 g levende fisk L"1 24 h"1. Kondisjonert vann ble enten brukt umiddelbart eller frosset for senere bruk.

Et vertikalt Y-rør bianalyse modifisert av Bailey et al. (2006) fra tidligere beskrevet av Ingvarsdottir et al. (2002a) ble anvendt for å studere L. salmonis copepodid-aktivering og retningsbestemte (taxis) responser til verts semiokjemiske komponenter og potensielle vertsmaskerende forbindelser. Y-røret ble konstruert av glass (1 cm sylinderdiameter) formet i en "Y"- design mellom to glassark av glass (2 mm tykke). Armene var 6,5 cm i lengde og hovedarmen var 8 cm lang. Hovedarmen av Y-røret ble tilpasset med en glasstopper og filtrert for å hindre copepodidene fra å entre utgangsstrømmen av røret og til avfall. En sprøytepumpe (SP 200 iz, World Precision Instruments, Florida, USA) som omfatter to plastsprøyter av 60 ml (Terumo Monoject, New Jersey, USA), som ble ladet med testlukter før anvendelse. Sprøyte-pumpen ble programmert til å avgi en konsistent strømningsrate på 2 ml min"1.

Kjemiske fargestoffer viser en klar demarkering av strømmen ned hver arm og ingen blanding av vann i hovedarmen i T-røret.

Idet enkelt kjemiske stimuli ble testet for eksempel laksekondisjonert vann (SCW), ble testvannet introdusert til en arm mens artifisielt sjøvann (ASW) ved 32 %o ble introdusert til den andre.

Dersom man testet en av isotiocyanatene for eksempel, ble sjøvann introdusert inn i en arm mens SCW pluss isotiocyanatet i den ønskete konsentrasjon ble introdusert til den andre. Introduksjon av stimuli ble alternert mellom venstre og høyre inngangs-arm under hvert eksperiment, med vasking derimellom, for å eliminere posisjonsbias. Ved starten av hvert eksperiment ble Y-røret fylt og kjørt med sjøvann og sjøvann pluss en teng/maskeringskjemikal, og en enkelt copepodid ble introdusert ved anvendelse av PTFE- rør og sprøyte inn i røret i et punkt 1,5 cm over basen til hovedarmen. Copepodiden ble tillatt maksimalt 3 minutter for å respondere. Hvert forsøk består av 1 copepodid.

Replikattester ble utført over en periode på fire dager for å monitorere aldrings-effekter av lusen på resultatene.

Atferden ble definert med grad av bevegelse innen Y-røret, som beskrevet av Ingvarsdottir et al. (2002b). Atferd ble delt inn i to kategorier, lav og høy. Lav aktivitet ble definert som bevegelse av copepodidene mindre enn lengden av hovedarmen. Høy aktivitet ble definert som bevegelse av copepodidene mer enn lengden av hovedarmen. Bevegelse inn i en arm ble også vurdert som høy aktivitet. Både aktivering og retningsresponser av copepodider ble målt. For retningsresponsene ble antallet copepodider som valgte stimuliarmen i stedet for kontrollarmen innen den allokerte 3 minutters periode sammenlignet med kontroll hvori sjøvann var presentert i begge armer.

Kjemikalier anvendt i adferdsbioanalysene var tilgjengelig fra Chemical Ecology Group at Rothamsted Research, Harpenden, Hertfordshire, UK. Løsninger av individuelle kjemikalier i etanol (0,001, 0,01, 0,1 og 1 mg/ml) ble fremstilt, og fortynnet til 1 ul/l i artifisielt sjøvann (Ingvarsdottir et al., 2002b) for å gi en final konsentrasjon på 0,1, 1, 10, 100 og 1000 deler per trillion (ppt) respektivt.

Copepodid-responser til ASW (Artifisielt sjøvann) og SCW (Laksekondisjonert sjø-vann) over alle forsøksdager ble sammenlignet i første instans ved anvendelse av en chi-kvadrat test for å bestemme om der var en dagseffekt på luseatferd. Dersom dette var ikke- signifikant medfører det at dataene er konsistente over alle dager og derfor kan sammenlignes.

For retningsresponser og eksperimenter på aktivitet er nullhypotesen at alle lus i alle behandlinger oppførte seg som om de ble testet ved anvendelse av en "global" x2 kontigenstabell (Zar, 1999). Ved avvising av denne hypotese ble data analysert med post hoc målrettet parvise sammenligninger ved anvendelse av 2 x 2 x2 kontigens tabell (Zar, 1999) for å identifisere om interessante par av behandlinger var signifikant forskjellige.

Eksperimenter som tester om allyl isotiocyanat kan maskere attraktiviteten av laksekondisjonert vann ble utført i to blokker. I tillegg til x2 analyser av de opprinnelige data (blokk 1), ble binomial logistisk regresjon anvendt for å teste om copepodid-retning og aktiveringsresponser var forskjellig både mellom eksperimentelle behandlinger (laksekondisjonert vann presentert alene, eller med tre konsentrasjoner av ally isotiocyanat, mot en artifisiell sjøvannkontroll) og mellom blokker. To separate modeller ble konstruert, med enten copepodid retningsrespons (test eller kontroll) eller aktivitet (høy eller lav) innført som den avhengige variable. I begge tilfeller ble behandling og blokk innført som faktorer, med en behandling med blokk interaksjon inkludert for å teste om luseresponsen til hver behandling varierte mellom blokker. Signifikans av termer i begge modeller ble undersøkt gjennom trinnvis deletering (forandringer i devians undersøkt gjennom x2 - tester) og sammenligning av responser for hver konsentrasjon av allyl isotiocyanat med hensyn til laksekondisjonert vann (ingen allyl isotiocyanat) utført ved anvendelse av Wald- statistikk.

For retningsresponser, det vil si oppstrøms positiv reotaksis, viste global x2 at lys ikke oppførte seg på samme måte i alle behandlinger (x2 = 26,42, df = 3, P < 0,001). Sammenlignet med sjøvannkontroll valgte signifikant flere copepodider armen som inneholder isoforon (x2 = 6,87, df = 1, P < 0,01), en komponent av laksekondisjonert vann. En signifikant reduksjon i copepodid responser ble detektert med isoforon pluss hvitløkolje (x2 = 8,72, df = 1, P < 0,01) og med hvitløkolje alene (x2 = 25,1, df = 1, P < 0,001) sammenlignet mot isoforon responser (Figur 1a). Antallet L. salmonis copepodider som gjør retningsresponser, og som ikke velger og det totale antall replikater for hver behandling er presentert i tabell 2a.

Under kontrollbetingelser, idet kun sjøvann var til stede i begge armer i Y-røret, viste 68 % av copepodidene lav aktivitet, og 32 % var i høy aktivitets kategorien. Global x2 viste at lusene ikke oppførte seg på samme måte i alle aktivitetsbehandlinger (x2 = 72,81, df = 3, P < 0,001). Ved sammenligning med sjøvannkontroll ble en signifikant økning i høy aktivitetsatferd observert i nærvær av isoforon (x2 = 36,57, df = 1, P < 0,001). Signifikant flere copepodider viste lav aktivitet med isoforon pluss hvitløkolje sammenlignet mot isoforon responser (x2 = 7,25, df = 1, P < 0,01). Imidlertid, ingen forskjell i aktivitet ble detektert mellom hvitløkolje alene og isoforon (x2 = 0, df = 1, NS; Figur 1b).

For retningsresponser viste den globale x2 at lusene ikke oppførte seg på samme måte i alle behandlinger (x2= 14,17, df = 3, P < 0,001). Sammenlignet med sjøvann-kontroll valgte signifikant flere copepodider den arm som inneholder laksekondisjonert vann, SCW (x2 = 11,82, df = 1, P < 0,001). En signifikant reduksjon i copepodid responser ble oppnådd med SCW pluss 50 ppt diallyl disulfid (x2 = 9,43, df = 1, P < 0,01) og SCW pluss 10 ppt diallyl sulfid (x2 = 16,54, df = 1, P < 0,001) sammenlignet mot SCW responser (Figur 2a). Antallet L. salmonis copepodider som gjør retningsresponser, som ikke velger og det totale antallet replikater for hver behandling er presentert i tabell 2b.

Under kontrollbetingelser, idet kun sjøvann foreligger i begge armer av Y-røret viste 62 % av copepodidene lav aktivitet, og 38 % var i høy aktivitetskategori. Den globale X2 viste at lusene ikke oppførte seg på samme måte i alle behandlinger (x2 = 80,89, df = 3, P < 0,001). Sammenlignet med sjøvannkontroll ble en signifikant økning i høyaktivitet oppnådd i nærvær av SCW (x2 = 80,54, df = 1, P < 0,001).

Signifikant flere copepodider viste lav aktivitet i nærvær av SCW pluss 50 ppt diallyl disulfid (x2 = 43,84, df = 1, P < 0,001) og SCW pluss 10 ppt diallyl sulfid (x2 = 33,25, df = 1, P < 0,001) sammenlignet mot SCW- responser (Figur 2b).

Den global x2 viste at lus oppførte seg på samme måte i alle behandlinger (x2 = 7,25, df = 4, NS) i retningsresponsanalyse. Som et resultat, ytterligere parvise sammenligninger ble ikke utført (Figur 3a). Antallet L. salmonis copepodider som utfører retningsresponser, som ikke velger, og det totale antall replikater for hver behandling er presentert i tabell 2c.

Den globale x2 viste at lus ikke oppfører seg på samme måte i alle aktivitetsbehandlinger (x2 = 42,02, df = 4, P < 0,001). Sammenlignet med sjøvannkontroll ble en signifikant økning i høyaktivitet detektert med SCW (x2 = 19,64, df = 1, P < 0,001). Signifikant flere copepodider viste lav aktivitet med SCW pluss 1 ppt diallyl sulfid (x2 = 4,44, df = 1, P < 0,05) sammenlignet mot SCW responser. Ingen forskjell i aktivitet ble detektert mellom SCW pluss 0,1 (x2 = 1,03, df = 1, NS) og 10 ppt diallyl sulfid (x2 = 2,11, df = 1, NS; Figur 3b).

Den globale x2 viste at lus ikke oppførte seg på samme måte i alle behandlinger (x2 = 26,50, df = 4, P < 0,001) i retningsresponsanalyse. Sammenlignet med sjøvann-kontroll valgte signifikant flere copepodider den arm som inneholder laksekondisjonert vann, SCW (x2 = 11,82, df = 1, P < 0,001). En signifikant reduksjon i copepodid responser ble detektert med SCW pluss 100 ppt 2-fenyletyl (x2 = 13,06, df = 1, P < 0,001) og SCW pluss 100 ppt butyl isotiocyanat (x2 = 15,14, df = 1, P < 0,001) sammenlignet mot SCW - responser. Ingen forskjell i retningsresponser ble detektert mellom SCW pluss 100 ppt 4-pentenyl isotiocyanat og SCW responser (x2 = 0,7, df = 1, NS; Figur 4a). Antallet L. salmonis copepodider som utfører retnings responser, som ikke velger, og det totale antallet replikater for hver behandling er presentert i tabell 2d.

Den globale x2 viste at lus ikke oppførte seg på samme måte i alle aktivitetsbehandlinger (x2= 97,56, df = 4, P < 0,001). Sammenlignet med sjøvannkontroll ble en signifikant økning i høy aktivitet detektert med SCW (x2 = 80,54, df = 1, P < 0,001). Signifikant flere copepodider viste lav aktivitet med SCW pluss 100 ppt 4-pentenyl (x2 = 25,97, df = 1, P < 0,001), 100 ppt 2-fenyletyl (x2 = 41,40, df = 1, P < 0,001) og 100 ppt butyl isotiocyanat (x2 = 75,42, df = 1, P < 0,001) sammenlignet mot SCW - responser (Figur 4b).

Den globale x2 viste at lusene ikke oppførte seg på samme måte i alle behandlinger (X2= 39,84, df = 2, P < 0,001) i retningsresponsanalysene. Ved sammenligning med sjøvannkontroll valgte signifikant flere copepodider den arm som inneholder laksekondisjonert vann, SCW (x2 = 7,42, df = 1, P < 0,01). En signifikant nedgang i copepodidresponser ble detektert med SCW pluss 100 ppt propyl isotiocyanat (x2 = 39,58, df = 1, P < 0,001) sammenlignet mot SCW- responser (Figur 5a). Antallet L salmonis copepodider som utfører retningsresponser, som ikke velger og det totale antall replikater for hver behandling er presentert i tabell 2e.

Den globale x2 viste at lusene ikke oppførte seg på samme måte i alle aktivitetsbehandlinger (x2= 59,78, df = 2, P < 0,001). Sammenlignet med sjøvannkontroll ble en signifikant økning i høy aktivitet detektert med SCW (x2 = 26,69, df = 1, P < 0,001). Ingen forskjell i aktivitet ble detektert mellom SCW pluss 100 ppt propyl isotiocyanate imidlertid (x2 = 0, df = 1, NS; Figur 5b).

Den globale x2 viste at lusene ikke oppfører seg på samme måte i alle behandlinger (X2 = 23,99, df = 4, P < 0,001) i retningsresponsanalysene. Sammenlignet med sjøvannkontroll valgte en signifikant større andel copepodider armen som inneholder laksekondisjonert vann, SCW (x2 = 8,01, df = 1, P < 0,01). En signifikant reduksjon i copepodidresponser ble detektert med SCW pluss 10 ppt (x2 = 5,84, df = 1, P <

0,05) og 100 ppt butyl isotiocyanat (x2 = 20,81, df = 1, P < 0,001) sammenlignet mot SCW- responser. Imidlertid, ingen forskjell i retningsresponser ble detektert mellom SCW pluss 1 ppt butyl isotiocyanat og SCW responser (x2 = 1,84, df = 1, NS; Figur 6a). Antallet L. salmonis copepodider som utfører retningsresponser, som ikke velger og det totale antall replikater for hver behandling er presentert i tabell 2f.

Den globale x2 viste at lus ikke oppfører seg på samme måte i alle aktivitetsbehandlinger (x2= 91,94, df = 4, P < 0,001). Sammenlignet med sjøvannkontroll ble en signifikant økning i høy aktivitet detektert med SCW (x2 = 75,04, df = 1, P < 0,001). Signifikant flere copepodider viste lav aktivitet med SCW pluss 100 ppt butyl isotiocyanat (x2 = 15,43, df = 1, P < 0,001) sammenlignet mot SCW- responser.

Ingen forskjell i aktivitet ble detektert mellom SCW pluss 1 og 10 ppt butyl isotiocyanat imidlertid (x2 = 2,65 og 2.64 respektivt, df = 1, NS; figur 6b).

Den globale x2 viste at lusene oppførte seg på samme måte i alle behandlinger (x2 = 4,65, df = 4, NS) i retningsresponsanalysene. Som et resultat, ytterligere parvise sammenligninger ble ikke utført (figur 7a). Antallet L. salmonis copepodider som utfører retningsresponser, ikke velger og det totale antallet replikater for hver behandling er presentert i tabell 2g.

Den globale x2 viste at lusene ikke oppførte seg på samme måte i alle aktivitetsbehandlinger (x2= 37,24, df = 4, P < 0,001). Sammenlignet med sjøvannkontroll viste en signifikant økning høy aktivitet detektert med SCW (x2 = 27,99, df = 1, P < 0,001). Ingen forskjell i aktivitet ble imidlertid detektert mellom SCW pluss 1,10 eller 100 ppt allyl isotiocyanat og SCW- responser (x2 = 2,24, 1,54, 3,04 respektivt, df = 1, NS; figur 7b).

Effekten av behandling på lus retningsresponser ble funnet å avvike mellom blokkene, som vist med en signifikant behandling med blokk interaksjonsterm (x2 = 8,24, df = 3, P < 0,05). Idet ingen total forskjell i luseatferd var funnet mellom behandlinger i eksperimenter utført i blokk 1 Guli 2005; x2 = 4,24, df = 3, NS; figur 7c), ble en totaleffekt av behandling funnet i blokk 2 (juni-oktober 2006; x2 = 9,11, df = 3, P < 0,05; figur 7d), med ferre copepodider som valgte testarmen i nærvær av 100 ppt allyl isotiocyanat enn SCW presentert ikke- maskert (Wald = 4,65, df = 1, P < 0,05; figur 7c).

Der var ingen signifikant effekt av blokk ved behandling (x2 = 5,09, df =3, NS) eller blokk (x2 = 0,001, df = 1, NS) på aktiveringsresponsene, nos som muliggjør at data kan samles over blokkene. Ingen påfølgende total forskjell i aktiveringsresponser ble funnet over behandlinger (x2 = 1,90, df =3, NS; figur 7d). Antallet L. salmonis copepodider som utfører retningsresponser, som ikke velger, og det totale antall replikater for hver behandling er presentert i tabell 2h.

Den globale x2 viste at lus ikke oppfører seg på samme måte i alle behandlinger (x2 = 33,38, df = 4, P < 0,001) i retningsresponsanalysene. Sammenlignet med sjøvann-kontroll valgte en signifikant større andel copepodider en arm som inneholder laksekondisjonert vann, SCW (x2 = 7,89, df = 1, P < 0,01). En signifikant reduksjon i copepodidresponser ble detektert med SCW pluss 100 ppt lavendel (x2 = 19,03, df = 1, P < 0,001) og 100 ppt rosemarin (x2 = 17,89, df = 1, P < 0,001) sammenlignet mot SCW- responser.

Imidlertid, ingen forskjell i retningsresponser ble detektert mellom SCW pluss 100 ppt pors og SCW- responser (x2 = 0,01, df = 1, NS; figur 8a). Antallet L. salmonis copepodider som utfører retningsresponser, som ikke velger, og det totale antall replikater for hver behandling er presentert i tabell 2i.

Den globale x2 viste at lusene ikke oppfører seg på samme måte i alle aktivitetsbehandlinger (x2= 144,34, df = 4, P < 0,001). Sammenlignet med sjøvannkontroll ble en signifikant økning i høy aktivitet detektert med SCW (x2 = 91,70, df = 1, P <

0,001). Signifikant flere copepodider viste lav aktivitet med SCW pluss 100 ppt pors (X2 = 12,23, df = 1, P < 0,001) og SCW pluss 100 ppt rosemarin (x2 = 43,24, df = 1, P < 0,001) sammenlignet mot SCW- responser. Ingen forskjell i aktivitet ble imidlertid detektert mellom SCW pluss 100 ppt lavendel (x2 = 2,03, df = 1, NS; figur 8b).

Den globale x2 viste at lusene ikke oppførte seg på samme måte i alle behandlinger (X2= 19,35, df = 3, P < 0,001) i retningsresponsanalysene.

Sammenlignet med sjøvannkontroll valgte signifikant flere copepodider armen som inneholder laksekondisjonert vann, SCW (x2 = 7,89, df = 1, P < 0,01). En signifikant reduksjon i copepodidresponser ble detektert med SCW pluss 1,000 ppt pors (x2 = 15,88, df = 1, P < 0,001) sammenlignet mot SCW- responser. Ingen forskjell i retningsresponser ble detektert mellom SCW pluss 100 ppt pors og SCW- responser (X2 = 0,01, df = 1, NS; figur 9a). Antallet L. salmonis copepodider som utfører retningsresponser, som ikke velger, og antallet replikater for hver behandling er presentert i tabell 2j.

Den globale x2 viste at lusene ikke oppfører seg på samme måte i alle aktivitetsbehandlinger (x2= 122,56, df = 3, P < 0,001). Sammenlignet med sjøvannkontroll ble det detektert en signifikant økning i høy aktivitet med SCW (x2 = 91,70, df = 1, P <

0,001). Signifikant flere copepodider viste lav aktivitet med SCW pluss 100 ppt pors (X2 = 12,23, df = 1, P < 0,001) sammenlignet mot SCW- responser. Ingen forskjell i aktivitet ble imidlertid detektert mellom SCW pluss 1000 ppt pors (x2 = 0,81, df = 1, NS; figur 9b).

Den globale x2 viste at lusene ikke oppførte seg på samme måte i alle behandlinger (X2= 19,46, df = 3, P < 0,001) i retningsresponsanalysene.

Sammenlignet med sjøvannkontroll valgte signifikant flere copepodider den arm som inneholder laksekondisjonert vann, SCW (x2 = 7,89, df = 1, P < 0,01). En signifikant reduksjon i copepodidresponsene ble detektert idet SCW pluss 100 ppt (x2 = 19,03, df = 1, P < 0,001) og 1000 ppt lavendel (x2 = 7,02, df = 1, P < 0,01) ble sammenlignet mot SCW responsene (figur 10a). Antallet L. salmonis copepodider som utfører retningsresponser, som ikke velger, og det totale antall replikater for hver behandling er presentert i tabell 2k.

Den globale x2 viste at lusene ikke oppførte seg på samme måte i alle aktivitetsbehandlinger (x2= 160,36, df = 3, P < 0,001). Sammenlignet med sjøvannkontroll ble en signifikant økning i høy aktivitet detektert med SCW (x2 = 91,70, df = 1, P < 0,001). Ingen forskjell i aktivitet ble detektert mellom SCW pluss 100 ppt (x2 = 2,03, df = 1, NS) og 1000 ppt lavendel (x2 = 0,81, df = 1, NS; figur 10b).

I dette studium har det blitt vist at copepodid larver av lakselus, L. salmonis, viste signifikante retningsresponser til isoforon, en komponent i laksekondisjonert vann.

Isoforn har blitt identifisert som en atferdsaktiv komponent i laksekondisjonert vann (Bailey et al., 2006) og ble derfor anvendt som et vertstegn for å utløse en respons i preliminære eksperimenter. Inkludering av hvitløkolje med isoforon, fjernet attraksjonen til isoforon. I seg selv syntes det som om hvitløkolje frastøter lusene til det artifisielle sjøvann. Det antydes således her at hvitløkolje kan fungere som et lusavstøtingsmiddel og/eller for å maskere vertslukstegn, det vil si som et semio-kjemisk maskerings- og attraksjonsreduserende materiale.

Vi har også funnet at tilsetning av 50 og 10 deler per trillion diallyl sulfid fjernet attraksjonen til laksekondisjonert vann. Diallyl sulfid i 10 deler per trillion syntes å være den mest effektive maskeringsforbindelse.

Videre, vi har vist at 2-fenyletyl, butyl og propyl isotiocyanat i 100 deler per trillion konsentrasjon, fjernet attraksjonen av copepodidene til laksekondisjonert vann. 4-pentenyl isotiocyanat maskerte ikke copepodidresponsene til laksekondisjonert vann. Doseresponseksperimenter med butyl isotiocyanat viste at 100 deler per trillion å være den mest effektive konsentrasjon for å kople av responsene til laksekondisjonert vann. Allyl isotiocyanat doseresponsanalyser antyder en mulig effekt ved 100 deler per trillion.

For planteekstraktene var både rosmarin og lavendel ved 100 deler per trillion effektive i å maskere laksekondisjonert vann. Pors doseresponsanalyser viste signifikant maskering å forekomme ved 1000 ppt konsentrasjon.

Et stort antall som ikke valgte fremkom i alle sjøvannkontroller og skyldes en mangel på tegn for å stimulere en atferdsrespons fra lusene.

Generelt, sjøvannkontrollene viste hovedsakelig lav aktivitet atferd i copepodider. Dette ble omkoplet til høy aktivitet i nærvær av et positivt tegn, det vil si enten isoforon eller laksekondisjonert vann.

Lav aktivitet fremkom igjen i profilen idet testforbindelsene ble introdusert, noe som antyder at kjemikaliene maskerer effekten av isoforon eller laksekondisjonert vann i copepodider. Graden av maskering varierte mellom forbindelser og er tenkt å være relatert til den opprinnelige feltkilde for L. salmonis.

Anvendelse av planteavledete maskeringsforbindelser er blitt vist å signifikant ødelegge L. salmonis copepodidattraksjon til vert (laks) kondisjonert vann in vitro. Ved å maskere profilen av nøkkelgjenkjenningsmolekyler i verten var det over-raskende mulig å signifikant redusere vertsresponsen for både L. salmonis og C. rogercresseyi. I de viste serier av Y-rør undersøkelser viste lakselus en signifikant aktivitet mot vertlukter fra kontroll Atlantisk laks. Inkludering av en serie maskeringsforbindelser av vegetabilsk opprinnelse reduserte effektivt denne respons i begge arter. Diallyl sulfid, diallyl disulfid, butyl isotiocyanat, allyl isotiocyanat, propyl Isotiocyanat, rosmarinolje, lavendelolje og pors ble identifisert som kandidat-forbindelser for å maskere laksevertforbindelser.

De følgende forbindelser og konsentrasjoner var spesielt lovende: Diallyl sulfid (10 deler per trillion), diallyl disulfid (100 deler per trillion), butyl isotiocyanat (100 deler per trillion), propyl isotiocyanat (100 deler per trillion) rosemarinolje (100 deler per trillion), lavendelolje (100 deler per trillion) og pors (1000 deler per trillion).

Evaluering av effekten av maskeringsforbindelser på kjemiske tegn frigjort av Atlantisk laks.

Atlantisk laks, S. salar utklekkingsdyrket for forråd produsert ved vestkysten i Puerto Montt (Chile). For fremstilling av laksekondisjonert vann (SCW), ble en fiskevert (100-200 g) plassert i en vannrenne i 241 med artifisielt sjøvann (100 I) (Aquarium salt; SERA, Heinsberg, Tyskland) med en saltgehalt på 32 %o ved 12 °C. Strøm-ningsraten i vannrennen var 30 cm s-1 (Ingvarsdottir et al., 2002b). Vannet som ble holdt i denne vannrennen ble anvendt for bioanalyser, eller frosset ned for anvendelse i kjemiske analyser.

Lus.

Ovigerous C. rogercresseyi hunnkjønn ble samlet fra ferskt høstet Atlantisk laks, på kommersielle fiskeoppdrettsanlegg på vestkysten av Puerto Montt (Chile). Eggstrenger ble forsiktig fjernet fra deres tilfestingspunkt på voksne hunnkjønn ved anvendelse av ultrafine pinsetter og ble plassert i et 500 ml glassdyrkningsflaske med artifisielt sjøvann og holdt i suspensjon med en luftforsyning gjennom stammen ved 12 °C og de ble holdt i absolutt mørke inntil copepodidfasen ble nådd.

Butyl isotiocyanat (B1), Diallyl sulfid (B2) og Diallyl disulfid (B3) ble selektert som testforbindelser. Hver av forbindelsene ble fremstilt i tre løsninger med etanol 1,0; 0,01 og 0,001 mg ml"1, deretter fortynnet til 1 ul 1-1 i laksekondisjonert vann (SCW).

Et vertikalt Y-rør bioanalyse modifisert fra det som tidligere var beskrevet ble anvendt for å studere C. rogercresseyi copepodid aktivering og retnings (taxis) responser til vertlukter. Y-røret var fremstilt av pleksiglass. Armene var 5 cm i lengde og hovedarmen var 6 cm lang.

Vann strømmet gjennom hver arm fra reservoarer posisjonert umiddelbart over Y-røret i en hastighet på 2 ml. min-1. I kontrollanalysene ble artifisielt sjøvann introdusert i begge armer i Y-røret. Ved testing av laksekondisjonert vann (SCW) pluss maskeringsforbindelser ble testvann introdusert i den ene arm mens sjøvann ble introdusert i den andre.

Ved starten av hvert eksperiment ble Y-røret tillatt å fylles, og en enkelt copepodid ble introdusert med polytetrafluoretylen rørledning (1 mm indre diameter (i.d.)) og sprøyte inn i røret i et punkt 1 cm over basis av hovedarmen.

Copepodidet ble tillatt maksimum 5 minutter til å respondere. Atferd ble definert med grad av bevegelse innen Y- røret som beskrevet tidligere. Atferd ble definert i to kategorier, lav og høy. Lav aktivitet ble definert som bevegelse av copepodidet på mindre enn lengden av hovedarmen. Høy aktivitet ble definert som bevegelse av copepodidet på mer enn lengden av hovedarmen. Preferanse ble observert idet copepodidet med høy aktivitet valgte en av armene. Både aktivering og retningsresponser av copepodider ble målt. Hvert forsøk besto av en copepodid, og hver copepodid ble aldri brukt mer enn en gang. Det var 30 til 100 forsøk utført for hvert eksperiment.

Nivået av preferanser ble påvirket idet maskeringsforbindelsene ble tilsatt. B1 ved 0,01 og 1 mg/ml syntes å forandre preferanse vist av sjølusene ved en lavere konsentrasjon og kontroll (fig 11 A).

B2, ved alle konsentrasjoner, viste en maskeringseffekt på de kjemiske tegn som frigjøres av Atlantisk laks, selv om ingen signifikante forskjeller (fig 11B). B3 ved 0,001 mg/ml forandret signifikant (P > 0,05) preferansen av copepodidene (fig 11C). En preferanseindeks (IP) ble beregnet. IP = # besøk ved stimulussoner/# besøk i kontrollsonen. Som indikerer, dersom IP = 1 er der ingen unngåelse eller preferanse, dersom IP > 1 indikerer dette at der er en preferanse for stimulus, og dersom IP er < 1 så indikerer det en unngåelse for stimulus eller en preferanse for kontroll.

Dette forsøk viste at IP beregnet for B1 viste at de høyeste konsentrasjoner (0,01 og 1,0 mg ml - 1 )reduserte preferanse for stimulus av Atlantisk laks. I tilfellet for maskerte B2 og B3 viste IP at begge forbindelser var effektive i deres virkning på maskeringskjemikaltegn (fig 12).

Effekter av B'ene i for på ødeleggelse av copepodid bosetning av Caligus rogercresseyi

Formålet med dette eksperiment var å validere effekten av tre maskeringsforbindelser i for på ødeleggelse av copepodidbosetting og in vivo utfordrings-analyse.

Isobutyl tiocyanat (B1), Diallyl sulfid (B2) og Diallyl disulfid (B3) ble selektert som testforbindelser..

Atlantisk laks, Salmo salar (N = 168; 500 g gjennomsnitt), utklekkingsoppdrettsforråd produsert og opprettholdt i Chile før eksperimentet, ble smoltert gradvis gjennom en ferskvann til sjøvanngradient og holdt i en sirkulær tank (12 m3). Fisken ble pit-merket ved slutten av smoltifiseringen.

100 ovigerøse hunnkjønn C. rogercresseyi (5000 copepodider) for hver tank ble samlet fra ferskt høstet Atlantisk laks, S. salar og plassert i 2000 ml glassdyrknings-flasker med rent sjøvann, og holdt i suspensjon med en luftforsyning gjennom stammen ved 12 °C i absolutt mørke. Eggstrengene ble fjernet forsiktig fra deres tilfestingspunkt ved anvendelse av ultrafine pinsetter og ble plassert i en 2000 ml glassdyrkningsflaske med rent sjøvann og holdt i suspensjon med en luftforsyning ved 12 °C og holdt i absolutt mørke inntil copepodidfasen ble nådd. De utviklede copepodider ble anvendt for innfesting under forsøket.

14 fisk, individuelt veiet og merket, ble fordelt i 12 fiberglasstanker (350 I) med en gjennomstrømnings sjøvannsystem (32 %o) ved 13-14 °C. Tre tanker (replikater) ble anvendt for hver maskeringsforbindelsesdose og kontrolldiett.

En dosering av maskeringsforbindelser (B1, B2 og B3) (0,125 %) ble testet mot sjølusbosetning sammenlignet med en kommersiell diett anvendt som en kontroll. Foringsperioder var i 21 dager, før sjølusinnfesting (tabell 1). Post-innfestingsforing var i 8 dager.

Fisk ble utvalgt og fjernet for prøvetaking. Sjølus ble telt individuelt på hver fisk ved 8 dager post utfordring.

Fisk foret med butyl isotiocyanat (B1) viste en signifikant reduksjon på 42 % i nivåer av sjølus sammenlignet med kontroller (figur 13). Der var en tendens for en reduksjon i lusenivåer med både diallyl sulfid (B2) og diallyl disulfid (B3)

Det skal anerkjennes at trekkene ifølge oppfinnelsen beskrevet i foregående kan modifiseres uten å avvike fra rammen av oppfinnelsen.

Termen "semiokjemikalium" (semeon betyr et signal på gresk) er en generisk term som anvendes for en kjemisk substans eller blanding som bærer et budskap. Disse kjemikalier virker som meldingsbringere for medlemmer av den samme art eller i noen tilfeller også andre arter. Termen anvendes vanligvis innen feltet kjemisk økologi for å omfatte feromoner, allomoner, kairomoner, attraktanter og repellanter. Legg spesielt merke til at termen i denne søknad ikke er begrenset til meldingsbringere mellom samme art, og at termen spesifikt anvendes for å angi meldingsbringere mellom forskjellige arter, så som mellom en Salmonidae og en parasitt. Termen er tiltenkt å inkludere de kjemiske forbindelser som er spesifikke for attraksjon av parasitter til Salmonidae, og spesielt til attraksjon av sjølus til Salmonidae.

Claims

1. Fremgangsmåte for å maskere lukten av en fiskesemiokjemisk forbindelse i vann, karakterisert ved at et ekstrakt eller forbindelse tilsettes til nevnte vann eller det administreres til en fisk i nevnte vann, hvor nevnte ekstrakt eller forbindelse er valgt blant; i) et ekstrakt av hvitløk, rosmarin, lavendel eller pors, eller ii) en forbindelse av formel (I); hvor hver R1 uavhengig av hverandre er Ci-C4-alkyl eller C2-C3-alkenyl eller C2-C3-alkynyl, og hvor n er 1 eller 2, eller iii) en forbindelse er formel (II); hvor R1 er Ci-C4-alkyl eller C2-C3-alkenyl eller C2-C3-alkynyl, eller fenylalkyl.

2. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, hvor nevnte fiskesemiokjemikalium er isoforon.

3. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, hvor nevnte fiskesemiokjemikalium er 1-octen-3-ol eller 6-metyl-5-hepten-2-on.

4. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakterisert ved at nevnte fisk er en Salmonidae.

5. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakterisert ved at nevnte vann er Salmonidae-kondisjonert sjøvann eller nevnte fisk i vannet er en Salmonidae.

6. Fremgangsmåte i samsvar med krav 4 eller 5, karakterisert ved at nevnte Salmonidae er valgt blant gruppen som består av atlantisk laks, coho-laks, Chinook, regnbueørret, arktisk ørret og andre oppdrettede laksearter.

7. Fremgangsmåte i samsvar med av de foregående krav, karakterisert ved at fremgangsmåten reduserer attraksjon mellom en parasitt og nevnte fisk.

8. Fremgangsmåte i samsvar med krav 7, karakterisert ved at nevnte parasitt er en ectoparasitt.

9. Fremgangsmåte i samsvar med krav 8, karakterisert ved at nevnte ectoparasitt er sjølus ( Lepeophtheirus salmonis, Caligus sp.).

10. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakterisert ved at nevnte forbindelse er en forbindelse av formel (I).

11. Fremgangsmåte i samsvar med krav 10, karakterisert ved at minst én av R1 er-CH2-CH=CH2 eller-CH=CH-CH3.

12. Fremgangsmåte i samsvar med krav 10, karakterisert ved at begge R1-grupper er identiske, og er enten -CH2-CH=CH2 eller-CH=CH-CH3.

13. Fremgangsmåte i samsvar med krav 10, karakterisert ved at nevnte forbindelse er diallyl disulfid eller diallyl sulfid.

14. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakterisert ved at forbindelsen er en forbindelse av formel (II).

15. Fremgangsmåte i samsvar med krav 14, karakterisert ved at R1 er en Ci-C4-alkyl.

16. Fremgangsmåte i samsvar med krav 14, karakterisert ved at nevnte forbindelse er butyl isotiocyanat.

17. Fremgangsmåte i samsvar med krav 14, karakterisert ved at nevnte forbindelse er propyl isotiocyanat.

18. Fremgangsmåte i samsvar med krav 14, karakterisert ved at R1 er en C2-C3-alkenyl.

19. Fremgangsmåte i samsvar med krav 14, karakterisert ved at nevnte forbindelse er alkyl isotiocyanat.

20. Fremgangsmåte i samsvar med krav 14, karakterisert ved at nevnte fenylalkyl er fenylmetyl, fenyletyl eller fenylpropyl.

21. Fremgangsmåte i samsvar med krav 20, karakterisert ved at nevnte fenylalkyl er fenyletyl.

22. Fremgangsmåte i samsvar med krav 14, karakterisert ved at nevnte forbindelse er allyl-, propyl-, butyl-, pentenyl-, fenyletyl-isotiocyanater.

23. Fremgangsmåte i samsvar med krav 14, karakterisert ved at nevnte forbindelse er 2-fenyletyl isotiocyanat.

24. Fremgangsmåte for å redusere attraksjon mellom en parasitt og en fisk, eller for å redusere angrep eller infeksjon av en parasitt i en fisk, eller for behandling av en parasittinfeksjon i fisk, karakterisert ved at et ekstrakt eller forbindelse tilsettes til nevnte vann eller administreres til en fisk i nevnte vann, hvor nevnte ekstrakt eller forbindelse er valgt blant; i) et ekstrakt av rosmarin eller pors, eller ii) en forbindelse av formel (I); hvor hver R1 uavhengig av hverandre er Ci-C4-alkyl eller C2-C3-alkenyl eller C2-C3-alkynyl, og hvor n er 1 eller 2, eller iii) en forbindelse er formel (II); hvor R1 er Ci-C4-alkyl eller C2-C3-alkenyl eller C2-C3-alkynyl, eller fenylalkyl.

25. Fremgangsmåte i samsvar med krav 24, karakterisert ved at nevnte fisk er en Salmonidae.

26. Fremgangsmåte i samsvar med krav 24, karakterisert ved at nevnte vann er Salmonidae-kondisjonert sjøvann eller nevnte fisk i vannet er en Salmonidae.

27. Fremgangsmåte i samsvar med krav 25, karakterisert ved at nevnte Salmonidae er valgt blant gruppen som består av atlantisk laks, coho-laks, Chinook, regnbueørret, arktisk ørret og andre oppdrettede laksearter.

28. Fremgangsmåte i samsvar med krav 25, karakterisert ved at nevnte Salmonidae er atlantisk laks.

29. Fremgangsmåte i samsvar med krav 25, karakterisert ved at nevnte Salmonidae er regnbueørret.

30. Fremgangsmåte i samsvar med et av de foregående krav, karakterisert ved at fremgangsmåte reduserer attraksjonen mellom en parasitt og nevnte fisk.

31. Fremgangsmåte i samsvar med krav 30, karakterisert ved at nevnte parasitt er en ektoparasitt.

32. Fremgangsmåte i samsvar med krav 31,karakterisert ved at nevnte ektoparasitt er sjølus ( Lepeophtheirus salmonis, Caligus sp.).

33. Fremgangsmåte i samsvar med krav 24, karakterisert ved at nevnte forbindelse er en forbindelse av formel (I).

34. Fremgangsmåte i samsvar med krav 33, karakterisert ved at minst én av R1 er -CH2-CH=CH2 eller -CH=CH-CH3.

35. Fremgangsmåte i samsvar med krav 33, karakterisert ved at begge R1-grupper er identiske, og er enten -CH2-CH=CH2 eller-CH=CH-CH3.

36. Fremgangsmåte i samsvar med krav 33, karakterisert ved at nevnte forbindelse er diallyl disulfid eller diallyl sulfid.

37. Fremgangsmåte i samsvar med krav24, karakterisert ved at forbindelsen er en forbindelse av formel (II).

38. Fremgangsmåte i samsvar med krav 37, karakterisert ved at R1 er en Ci-C4-alkyl.

39. Fremgangsmåte i samsvar med krav 37, karakterisert ved at nevnte forbindelse er butyl isotiocyanat.

40. Fremgangsmåte i samsvar med krav 37, karakterisert ved at nevnte forbindelse er propyl isotiocyanat.

41. Fremgangsmåte i samsvar med krav 37, karakterisert ved at R1 er en C2-C3-alkenyl.

42. Fremgangsmåte i samsvar med krav 37, karakterisert ved at nevnte forbindelse er alkyl isotiocyanat.

43. Fremgangsmåte i samsvar med krav 37, karakterisert ved at nevnte fenylalkyl er fenylmetyl, fenyletyl eller fenylpropyl.

44. Fremgangsmåte i samsvar med krav 43, karakterisert ved at nevnte fenylalkyl er fenyletyl.

44. Fremgangsmåte i samsvar med krav 37, karakterisert ved at nevnte forbindelse er allyl-, propyl-, butyl-, pentenyl-, fenyletyl-isotiocyanater.

45. Fremgangsmåte i samsvar med krav 117, karakterisert ved at nevnte forbindelse er 2-fenyletyl isotiocyanat.

46. Forsammensetning omfattende konvensjonelle foringredienser så som lipider, proteiner, vitaminer, karbohydrater og mineraler, karakterisert ved at foret omfatter rosmarin eller pors.

47. Forsammensetning i samsvar med krav 46, karakterisert ved at nevnte rosmarin eller pors maskerer lukten av en fisk, fortrinnsvis en Salmonidae.

48. Forsammensetning i samsvar med krav 46, karakterisert ved at nevnte rosmarin eller pors maskerer lukten av salmonider i Salmonidae-kondisjonert sjøvann.

49. Forsammensetning i samsvar med krav 51, karakterisert ved at nevnte rosmarin eller pors maskerer lukten av isoforon eller 1 -octen-3-ol eller 6-metyl-5-hepten-2-on.

50. Forsammensetning omfattende konvensjonelle foringredienser så som lipider, proteiner, vitaminer, karbohydrater og mineraler, karakterisert ved at foret omfatter en forbindelse valgt blant en forbindelse av formel (I); hvor hver R1 uavhengig av hverandre er Ci-C4-alkyl eller C2-C3-alkenyl eller C2-C3-alkynyl, og hvor n er 1 eller 2.

51. Forsammensetning i samsvar med krav 50, karakterisert ved at minst én R1 er-CH2-CH=CH2 eller-CH=CH-CH3.

52. Forsammensetning i samsvar med krav 50, karakterisert ved at begge R1-grupper er identiske, og er enten -CH2-CH=CH2 eller-CH=CH-CH3.

53. Forsammensetning i samsvar med krav 50, karakterisert ved at nevnte forbindelse er diallyl disulfid.

54. Forsammensetning omfattende konvensjonelle foringredienser så som lipider, proteiner, vitaminer, karbohydrater og mineraler, karakterisert ved at foret omfatter en forbindelse av formel (I) hvor R1 er Ci-C4-alkyl eller C2-C3-alkenyl eller C2-C3-alkynyl, eller fenylalkyl.

55. Forsammensetning i samsvar med krav 54, karakterisert ved at R1 er Ci-C4-alkyl.

56. Forsammensetning i samsvar med krav 54, karakterisert ved at nevnte forbindelse er butyl isotiocyanat.

57. Forsammensetning i samsvar med krav 54, karakterisert ved at nevnte forbindelse er propyl isotiocyanat.

58. Forsammensetning i samsvar med krav 54, karakterisert ved at R1 er en C2-C3-alkenyl.

59. Forsammensetning i samsvar med krav 54, karakterisert ved at nevnte forbindelse er alkyl isotiocyanat.

60. Forsammensetning i samsvar med krav 54, karakterisert ved at nevnte fenylalkyl er fenylmetyl, fenyletyl eller fenylpropyl.

61. Forsammensetning i samsvar med krav 54, karakterisert ved at nevnte fenylalkyl er fenyletyl.

62. Forsammensetning i samsvar med krav 54, karakterisert ved at nevnte forbindelse er 2-fenyletyl isotiocyanat.

63. Forsammensetning i samsvar med krav 54, karakterisert ved at nevnte forbindelse er allyl-, propyl-, butyl-, pentenyl-, fenyletyl-isotiocyanater.

64. Forsammensetning i samsvar med krav 54, karakterisert ved at nevnte forbindelse eller ekstrakt i foret er i konsentrasjonsområdet av 0,01-0,5, fortrinnsvis i en konsentrasjon av 0,125% basert på vekt av foret.

65. Anvendelse av en forbindelse for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for hindring og/eller behandling av en parasittinfeksjon i fisk, fortrinnsvis en Salmonidae, hvor nevnte ekstrakt eller forbindelse er valgt blant; i) et ekstrakt av hvitløk, rosmarin, lavendel eller pors, eller ii) en forbindelse av formel (I); hvor hver R1 uavhengig av hverandre er Ci-C4-alkyl eller C2-C3-alkenyl eller C2-C3-alkynyl, og hvor n er 1 eller 2, eller iii) en forbindelse er formel (II); hvor R1 er Ci-C4-alkyl eller C2-C3-alkenyl eller C2-C3-alkynyl, eller fenylalkyl.

Drawings

Priority

02.12.2009 NO 20093460

Patent classes

IPC classes

A23K 20/10

A23K 50/80

A61K 31/10

A61K 31/26

A61K 36/8962

A61P 33/00

A23K 1/16

A23K 1/18

CPC classes

A23K 20/10

A23K 50/80

A23K 1/1612

A23K 1/1646

A23K 1/188

A61K 31/10

A61K 31/26

A61K 36/8962

A61P 33/00

Citations

Boxaspen, K.& Holm, J.C., "New biocides used against sea lice …..", I: Aquaculture and the environment,European Aquaculture society special publication No. 16 Gent, Belgium, Redaktører N. De Pauw and J. Joyce, 1991, s. 393-402. ()

Roth,M. et al., «Current practices in the chemotherapeutic control of sea lice infestations in aquaculture: A review», Journal of fish diseases, vol. 16, no.1 januar 1993, pages 1-26, XP009146063 ()

D3: FAQ s on Garlic, use in aquariums.garlic in the marine aquarium-A summary 2009.02.18. Side 1-2. (http://www.wetwebmedia.com/garlicfaqs.htm) ()

MORDUE LUNTZ, A J & BIRKETT, M A, " A review of host finding behaviour in the parasitic…", Journ. Of Fish Dis. volume 32 (2009.01.01),side 3-13. ()

Wikipedia. Insect repellent. (http://en.wikipedia.org/wiki/Insect_repellant) ()

TherA Formula & Garlic. New Life Spectrum Fish Food Forum. (http://www.newlife.ipbhost.com/forums/index.php?showtopic=256) ()

M.HORI & H.KOMATSU, " Repellency of rosemary oil and its components…", Appl.entomol.zool, 1997, vol 32 (2), side 303-310. ()

US 6855348 B2 (B2)

LICHTENSTEIN, E.P., "Insecticides occurring naturally in crops" I:Advances in chemistry, vol 53, kap 4, s 34-38. Se sammendrag. ()

EP 1208751 A1 (A1)

WO 2004036998 A1 (A1)

GB 2224934 A (A)

Bailey et al., «The role of semiochemicals in host location and non-host avoidance by salmon louse (Lepeophtheirus salmonis) copepodids», Can. J. Fish. Aquat. Sci. 63: page 448–456 (2006) ()

Applicants, owners and inventors

Applicants

Ewos Innovation AS

4335 DIRDAL

NO (GJESDAL Municipality, Rogaland county)

Org. number: 911501252

Inventors

José Luis González Vecino

Hetlandsgt. 26

4013 STAVANGER

NO (STAVANGER Municipality, Rogaland county)

Simon Wadsworth

Hjerteskjellveien 8

4310 HOMMERSÅK

NO (SANDNES Municipality, Rogaland county)

Jenny Mordue

Gowanbrae Road

AB159AQ BIELDSIDE, ABERDEEN

Jorge Pino

Los Alpes 99

PUERTO VARAS

Agent

ACAPO AS

Edvard Griegs vei 1

5059 BERGEN

NO (BERGEN Municipality, Vestland county)

Org. number: 915113737

Reference: P12106NO01

Status history

Payment history

Oppositions and appeals

No oppositions or appeals

Administrative limitation

No administrative limitation

Liens and licences

No liens or licenses registered

Gazette entries

No Gazette entries found

Only events from 2024.03.04 and onwards are shown.

Fremgangsmåte for å maskere lukt av en fiskesemiokjemisk forbindelse i vann, og en fôrsammensetning...

Key information

Abstract and drawing

Publications

Documents

Description, claims and drawings

Priority

Patent classes

Citations

Applicants, owners and inventors

Agent

Status history

Payment history

Oppositions and appeals

Administrative limitation

Liens and licences

Gazette entries